浸礦細菌胞外聚合層中多糖含量的測定

(東北大學 材料與冶金學院，遼寧 沈陽，110819)

細菌胞外聚合層(Extracellular polymers，EPS)普遍存在于微生物群體中，它是附著在細菌表面或圍繞在細菌周圍的菌體新陳代謝產物[1]，呈現松散透明黏液狀或是膠質狀[2]；其主要成分為多糖、蛋白質、脂肪等[3?4]。細菌胞外聚合層可用于細菌個體的自我保護、黏附聚集、空間構型、信息交流等[5?6]。在生物冶金中，細菌胞外聚合層是浸礦反應的發生場所[7]，具有調節硫化物表面吸附，影響離子交換，提高氧化活性等作用[8?9]。采用苯酚?硫酸法可測定浸礦細菌胞外聚合層中多糖的含量。該比色法的測定原理是：在強酸條件下，多糖在濃硫酸水合產生的高溫下迅速水解成單糖，并脫水生成糠醛衍生物，該衍生物與苯酚反應在 490 nm處有最大吸收峰的橙黃色物質，且其吸光度與濃度呈線性關系[10?11]。應用苯酚?硫酸法測定不同的糖類物質，其最佳測定條件不同，應以待測多糖作為研究對象，找出其最適測定條件，才能得到較準確的測定結果[12?13]。本文選取浸礦細菌胞外聚合層中的多糖為研究對象，通過單因素條件實驗，得出苯酚?硫酸法測定該多糖的最佳條件，并通過紅外光譜分析檢測該多糖的化學結構，以便為進一步研究浸礦過程中細菌胞外聚合層與礦物之間的作用機理提供技術支持。

1 材料及方法

1.1 菌種

供試菌種為HQ0211菌。該菌是混合浸礦菌株，由主體菌嗜酸氧化亞鐵硫桿菌以及嗜酸氧化硫硫桿菌和嗜酸氧化亞鐵微螺菌組成，其以Fe2+和S為能源，在pH為1.0～2.5、溫度為25～46 ℃條件下自養。

1.2 待測多糖的制備

1.2.1 培養菌液

菌液采用搖瓶培養：9K 培養基[14?15]內接入 10%的種子液(種子液的菌體質量濃度為108g/L)，初始pH調至1.7，控溫為44 ℃，轉速為190 r/min，待菌液生長至電位達 600 mV以上，得到生長處于穩定期的菌液。

1.2.2 胞外聚合層中多糖的提取

取3.0 mL培養的菌液于離心管中，以11 500 r/min常溫離心12 min，收集沉淀，沉淀中加入3.0 mL 3%EDTA溶液，混勻，以11 500 r/min再次常溫離心12 min，上清液用孔徑為0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液為待測的多糖樣品。

1.3 測定指標

多糖含量的測定采用苯酚?硫酸法，使用TU?1901紫外可見分光光度計測定吸光度；多糖化學鍵的結構分析采用Spectrum One紅外光譜儀掃描，固體樣品采用KBr壓片。

2 結果與討論

2.1 最佳測定條件的選擇

2.1.1 最大吸收波長

取多糖樣品1.0 mL置于試管中，加入濃硫酸5.0 mL，搖勻后加入質量分數為5%的苯酚溶液1.0 mL，混合均勻后在室溫下顯色20 min，得待測多糖的顯色液。以蒸餾水代替多糖，同樣按上述方法顯色，作為空白樣。采用分光光度計掃描顯色液的波長，掃面范圍設置為440～540 nm，根據掃描結果，確定最大吸收峰對應的波長為最大吸收波長。吸光度隨測定波長的變化如圖1所示。從圖1可見：在440～540 nm的掃描區域，顯色液的吸光度先增大后減小，且于490 nm處出現最大吸收峰，這說明浸礦細菌胞外聚合層中的多糖顯色液的最大吸收波長為490 nm。

圖1 多糖顯色液的波長掃描圖譜Fig.1 Wavelength scanning graph of polysaccharide color liquid

2.1.2 濃硫酸用量

取多糖樣品1.0 mL分別置于不同編號的試管中，依次加入濃硫酸4.0，4.5，5.0，5.5和6.0 mL，混勻后加入質量分數為5%的苯酚溶液1.0 mL，搖勻，于室溫下顯色20 min。同樣做每種濃硫酸用量的空白樣品實驗，并在最大波長490 nm處測定顯色液的吸光度。吸光度隨濃硫酸用量的變化結果如圖2所示。由圖2可見：顯色液的吸光度在濃硫酸用量為5.0 mL時達到最大，此后吸光度不隨濃硫酸用量的增加而增大，而是略有減小。這表明實驗中濃硫酸的用量存在最適值，即5.0 mL，高于或低于此用量時，都不能達到最佳的顯色效果。

圖2 濃硫酸用量對吸光度的影響Fig.2 Influence of sulfuric acid on absorbance

2.1.3 苯酚溶液質量分數

采用確定的最大吸收波長和最佳濃硫酸用量，改變苯酚溶液的質量分數，分別設定為3%，4%，5%，6%和7%，其他操作條件相同，同樣做每種質量分數的空白樣品實驗，測定多糖顯色液的吸光度。圖3所示為吸光度隨苯酚質量分數的變化結果。可見：當使用質量分數為 5%的苯酚溶液時，顯色液的吸光度達最大值，而且明顯大于其他顯色液的吸光度。該結果表明實驗中苯酚溶液的質量分數控制為 5%時可達最佳測定效果，即該質量分數的苯酚溶液恰好與糠醛衍生物充分反應。

圖3 苯酚質量分數對吸光度的影響Fig.3 Influence of concentration of phenol on absorbance

2.1.4 反應時間

按照確定的最佳測定條件，將所用多糖樣品和試劑全部加入后，迅速混勻，并采用掃描的方法測定反應時間，掃描時間設置為1 200 s。吸光度隨反應時間的變化結果如圖4所示。根據圖4可知，當多糖樣品和試劑混合后，反應立即發生，吸光度波動；反應發生200 s后結束，吸光度穩定。此結果說明：用苯酚?硫酸法測定浸礦細菌胞外聚合層中的多糖含量時，多糖和試劑反應200 s后吸光度才能穩定。

2.2 精密度和穩定性實驗

2.2.1 精密度實驗

按照最佳測定條件，進行平行實驗，結果如表 1所示。從表1可知：6次平行實驗的相對標準偏差為1.75%，低于2.00%，這表明采用苯酚?硫酸法測定浸礦細菌胞外聚合層中的多糖含量，結果精密度較高。

圖4 多糖顯色液的反應時間掃描圖譜Fig.4 Scanning graph of reaction time for polysaccharide color liquid

表1 平行實驗結果Table 1 Parallel experimental results

2.2.2 穩定性實驗

取多糖樣品1.0 mL，按上述最佳測定條件比色，測定顯色15，30，45，60，75和90 min時的吸光度，結果如圖5所示。從圖5可知：多糖顯色液在比色后的15～90 min內，吸光度穩定在一條直線上，基本不變。這表明采用苯酚?硫酸法測定浸礦細菌胞外聚合層中的多糖含量時，顯色液可穩定顯色90 min，即在多糖顯色的90 min內，顯色液的吸光度均為有效值。

2.3 標準曲線

2.3.1 標準曲線的制作

用干燥至恒重的蔗糖準確配置質量濃度為0.1 g/L的標準液。準確量取該蔗糖標準液0.05，0.10，0.15，0.20，0.25和0.30 mL于試管中，并分別用蒸餾水補至體積為1.0 mL，按照最佳測定條件比色，以蒸餾水做空白樣品實驗，測定吸光度，繪制蔗糖標準曲線，如圖6所示。該曲線的相關系數r=0.999，這表明：當蔗糖質量濃度為0～0.03 g/L時，質量濃度與吸光度之間基本符合郎伯?比爾定律，呈現良好的線性關系；即使用該標準曲線，可科學地計算多糖含量。

圖5 多糖顯色液的吸光度隨時間的變化曲線Fig.5 Absorbance curve for polysaccharide color liquid changing along with time

圖6 蔗糖質量濃度與吸光度的關系Fig.6 Relationship between sucrose concentration and adsorption

2.3.2 標準液的最大吸收波長

蔗糖標準液的吸收波長如圖7所示。由圖7可以看出：蔗糖標準液的最大吸收波長也為490 nm，與提取的多糖顯色液的一致。由此說明，提取的多糖與蔗糖標準液有相同的最大吸收波長；因而可根據蔗糖標準曲線計算浸礦細菌胞外聚合層中多糖的含量。

2.4 多糖含量的測定

將平行實驗得到的吸光度平均值0.119代入到標準曲線回歸方程中，計算出提取的浸礦細菌胞外聚合層中的多糖含量為12 mg/L。

2.5 多糖的紅外光譜檢測

圖7 蔗糖顯色液的波長掃描圖譜Fig.7 Wavelength scanning graph of sucrose color liquid

表2 多糖的紅外吸收峰Table 2 Infrared absorption band of polysaccharide

采用紅外光譜分析浸礦細菌胞外聚合層中多糖的化學結構，結果見表2。從表2可知，提取的多糖具有O—H，C=C，—CH3和C—H鍵，這些化學鍵符合糖類物質的結構特性，其可組成多糖的主體構架。

3 結論

(1) 采用苯酚?硫酸法測定浸礦細菌胞外聚合層中的多糖含量，其最佳測定條件如下：比色波長為490 nm，濃硫酸用量為5.0 mL，苯酚溶液質量分數5%，反應時間200 s，顯色反應穩定時間為90 min。

(2) 測定浸礦細菌胞外聚合層中的多糖含量時，苯酚?硫酸法具有較高的精密度和穩定性；選用蔗糖標準曲線可以客觀地計算提取的多糖含量；測得的穩定期菌液的多糖含量為12 mg/L。

(3) 浸礦細菌胞外聚合層中的多糖含有 O—H，C=C，—CH3和C—H等化學結構。

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