香茶菜屬植物中的三萜化合物對脂質過氧化和DNA損傷的保護作用

劉國安,閔建平,張佳佳,頡耀強,丁 蘭,楊 紅

（西北師范大學生命科學學院,蘭州替換為 730070）

香茶菜屬植物中的三萜化合物對脂質過氧化和DNA損傷的保護作用

劉國安＊,閔建平,張佳佳,頡耀強,丁 蘭,楊 紅

（西北師范大學生命科學學院,蘭州替換為 730070）

通過檢測對 H2O2處理的人外周血單個核細胞的DNA損傷、鼠肝微粒體脂質過氧化和pBR322 DNA氧化斷裂的保護作用,測定了從香茶菜中提取到的4種三萜化合物的抗氧化活性.結果表明,4種化合物在這3種體系中發揮著不同的作用.熊果酸在所有體系中保護作用最強;2α,3β-二羥基-烏蘇-12-烯-28-酸在抑制脂質過氧化時活性強,而在抑制單鏈DNA斷裂中作用較弱;其異構體2α,3α-二羥基-烏蘇-12-烯-28-酸作用正好相反;齊墩果酸僅在在 H2O2處理的單個核細胞層DNA損傷中具有微弱保護作用.

三萜化合物;香茶菜;抗氧化活性;彗星電泳;脂質過氧化;DNA鏈斷裂

唇形科植物香茶菜（labiatae isodon）在世界范圍,尤其在中國、日本和韓國種植廣泛.其中許多種類在中國是很重要的中草藥材,被用來作為抗炎、抗腫瘤、清熱解毒和治療無明腫痛的藥物[1],但目前對這些植物藥理學的研究還非常有限.

抗癌和抗炎癥的機制與抗氧化作用密切相關[2-3].因此,具有抗氧化性的化合物有望成為抗腫瘤和抗炎癥的候選藥物.單細胞凝膠電泳也稱彗星電泳技術,近些年被廣泛應用并得到不斷發展.被廣泛用于檢測具有潛在抗氧化作用的物質[4].微粒體,尤其是來自光面內質網的部分,因含有大量的多不飽和脂肪酸而易受氧化脅迫的影響,已被廣泛作為氧脅迫和抗氧化研究的一種模型.三萜化合物是香茶菜屬植物（Isodon）中的主要次生代謝物,本文中的4種三萜化合物是從總序香茶菜（Isodon racemosa（Hemsl）Hara）和蘭萼香茶菜（Isodon japonica（Burm.f）.Hara var.galaucocaly x（maxin）Hara.）中分離提純,經 IR,UV,MS和NMR等多種波普技術并結合標樣對照鑒定了它們的結構[5-6].本文檢測了它們對經 H2O2處理的人外周血單個核細胞中DNA損傷的保護作用、抑制小鼠肝微粒體中由Fe2+/VC啟動的脂質過氧化作用,以及對AAPH誘導的質粒DNA氧化斷裂的保護作用.

1 材料與方法

1.1 受試化合物與試劑

4種分離自香茶菜的三萜化合物為熊果酸（Ursolic acid,UA）、2α,3β-二羥基-烏蘇-12-烯-28-酸 （2α,3β,dihydroxy-urs-12-en-28-oid acid,HU1）、2α,3α-二羥基-烏蘇-12-烯-28-酸 （2α,3α,dihydroxy-urs-12-en-28-oid acid,HU2）和齊墩果酸（Oleanolic acid,OA）.結構見圖1.

AAPH（2,2-偶氮二（2-脒基丙烷）二鹽酸鹽）、瓊脂糖、溴化乙錠、抗壞血酸和蘆丁均購自 Sigma,質粒pBR322購自 SABC,其他試劑均為國產分析純.

1.2 對由 H2O2處理的單個核細胞DNA氧化損傷的保護作用

將新鮮分離的健康人外周單個核細胞分別與不同濃度的 4種三萜化合物進行孵育,以50μmol/L H2O2于4℃處理 10 min,通過單細胞凝膠電泳檢測單個核細胞中的DNA損傷[7].細胞DNA損傷時因其DNA斷裂,電泳時從核中遷出,呈彗星狀,無損傷的細胞DNA呈圓形.統計彗星狀細胞所占的百分率,可反映DNA損傷的程度.

圖1 從香茶菜屬（L abiatae Isodon）植物中分離提取的4種三萜化合物的結構Fig.1 Structure of seven triterpenoids from Labiatae Isodon

1.3 脂質過氧化的測定

微粒體的制備參照文獻[8].Wistar小鼠饑餓過夜后,斷頸處死并立即取出肝臟,勻漿經兩次離心后得微粒體.Lowry法測定蛋白質濃度.

將小鼠微粒體和不同濃度三萜化合物加入Fe2+/VC啟動的脂質過氧化反應體系.37℃振蕩孵育1 h后,三氯醋酸終止反應,加入硫代巴比妥酸顯色測定脂質過氧化產物丙二醛,上清液于532 nm比色.計算不同化合物的半抑制濃度（IC50）.

1.4 測定單鏈DNA氧化斷裂

質粒pBR322DNA主要以超螺旋型存在,當受到氧化損傷斷鏈時,DNA會先打開一條核酸鏈而解為環狀,當損傷進一步加強時,第二條核酸鏈也會被打開而呈線型.實驗時將100 ng的pBR322質粒DNA和化合物與10μmol/L自由基引發劑AAPH混勻,37℃孵育1 h.然后將樣品進行瓊脂糖凝膠電泳后,用 EB染色,于凝膠成像分析系統中觀察照相.

1.5 統計數據

實驗重復3次,數據以均值±SD表達.

2 結果與分析

2.1 對單個核細胞中H2O2處理的DNA氧化損傷的保護作用

如圖2所示,細胞經 H2O2處理后,DNA損傷的細胞呈彗星狀.未處理細胞只有9.6%呈彗星狀,此為單個核細胞的基礎 DNA損傷.當用50μmol/L H2O2處理細胞10 min后,有96.9%的細胞呈彗星狀.槲皮素（quercetin,Q）是實驗室經常使用的抗氧化劑.實驗中作參照.

圖2 單細胞凝膠電泳圖細胞DNA損傷（有尾）和無損傷（圓形）（×400）Fig.2 Cells image after single cell micro gel electrophoresis.Cells with（a long tail）and without（circular）damaged DNA

圖3 三萜化合物對 H2O2誘導的人外周血單個核細胞損傷的保護作用Fig.3 Protection of triterpenoids from H2O2-induced DNA damage in human peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）

4種化合物的作用從圖3可看出,它們對H2O2處理的DNA氧化損傷具有不同的保護能力,但作用都不強,均弱于槲皮素.OA與UA的作用相近,HU1和 HU2的作用相近.

2.2 對脂質過氧化的抑制作用

4種三萜化合物對小鼠肝微粒體的脂質過氧化均具有抑制作用,且存在濃度依賴性.如表1中顯示.其中UA的抑制作用最強,程度與槲皮素相當;HU1的抗氧化活性明顯強于 HU2,且差異較大（IC50HU1=33.1μmol/L,IC50HU2=103.9μmol/L）;而OA的活性很弱.UA與OA的結構相似,僅因CH3位置不同,UA的抑制作用就遠高于OA,比后者高20倍.4種三萜化合物對脂質過氧化的抑制作用的順序如下:UA>HU1>OA>HU2.

表1 三萜化合物對脂質過氧化的半抑制濃度Table 1.Half inhibition concentration（IC50）of triterpenoids on lipid peroxidation

2.3 對鏈狀DNA氧化斷裂的保護作用

為了進一步闡明三萜化合物的抗氧化作用,采用質粒pBR322 DNA,由 AAPH誘導斷裂,檢測化合物對無細胞體系DNA的保護作用.見圖4.

圖4 三萜化合物對AAPH引起的pBR322DNA斷裂的保護作用Fig.4 Effects of triterpenoids on pBR322 DNA strand break induced by 10mmol/L AAPH

從圖4（1）中可以清楚地看出,4種化合物對DNA氧化損傷都有一定的保護作用,并具濃度依賴性.UA作用較強,從25μmol/L起就表現出保護能力（1,D）,100μmol/L時可完全保護DNA損傷（1,F）,表現為超螺旋型pBR322質粒DNA的條帶和未處理樣（1,A）相同.而OA的作用很弱,在2 000μmol/L時仍只有微弱的保護效果（1,I）.在圖4（2）中,二種二羥基熊果酸也顯示較強的作用,且 HU2的作用強于 HU1.HU1在200μmol mol/L（2,D）時有明顯的作用,1 600μmol/L時完全保護（2,G）;而 HU2在400μmol/L時就有了完全的保護作用（2,J）,但 HU1與 HU2保護能力比UA弱.因此,對DNA氧化損傷的保護能力,由強到弱為UA>HU2>HU1>OA.

3 討論

人體的氧化脅迫狀態與炎癥、癌癥、自身免疫疾病、糖尿病、各種心腦血管疾病、老年性癡呆等有關.炎癥過程涉及激活吞噬細胞合成和釋放大量的活性氧,從而導致組織和細胞損傷[9].提高具有抗氧化能力物質的攝入可能預防和降低炎癥的發生.因此,很多實驗都在探討抗氧化劑作為治療相關疾病藥物的可能性[10].癌變過程是多步驟的復雜過程,但與氧化脅迫和炎癥造成的損傷密切相關[11].因此具有抗氧化和抗炎作用的化合物就有可能作為抗腫瘤藥物.

植物中廣泛存在三萜化合物.常見三萜化合物UA和OA最重要的生物活性是保肝[12],近些年有些研究報告了三萜類化合物的各種生物活性[13-14],但有關來自香茶菜的三萜化合物抗氧化作用方面的研究未見報道.彗星電泳可用來檢測檢H2O2誘導的細胞DNA損傷及化合物的保護作用[7].在脂質過氧化體系中,自由基攻擊多不飽和脂肪酸,形成各種細胞毒醛類物質.多種病理、生理過程涉及到脂質過氧化.AAPH在37℃能產生自由基造成DNA鏈斷裂等生物大分子損傷.

通過對4種三萜化合物在以上3個體系中抗氧化作用的檢測可以看出:UA在3個體系中均具有最強的保護作用;而其異構體OA僅能減輕單核細胞中 H2O2誘導的DNA氧化損傷,在脂質過氧化和pBR322質粒DNA氧化損傷中保護作用都非常弱;比 UA多了一個羥基的 HU1和 HU2在3個體系中作用差異較大,對細胞的DNA氧化損傷二者只有微弱作用,在脂質過氧化中,HU1的作用遠比 HU2強,約高2倍,而在對無細胞DNA氧化體系中,作用正好相反.

UA是在這三種測試體系中最有效的抗氧化劑.特別是在抑制脂質過氧化中,比其它化合物強5倍多.UA包含一個羥自由基而 HU有兩個,這意味著三萜化合物中僅是羥基的數目不能決定在這些條件下的抗氧化強度.這與其他抗氧化劑不同,如黃酮類化合物.但是,羥自由基確實是官能團.如果-OH被乙酰基 （AcO型）替換,抗氧化作用明顯減弱（數據未顯示）.HU1和 HU2有相同的結構骨架,只是第三位-OH的構型不同（見圖1）.在脂質過氧化體系中,HU1顯示很強的抑制活性（IC50=33.1）,HU2卻很弱 （IC50=103.9）;而在DNA氧化損傷的保護中正好相反,這意味著OH-的位置是很重要的,其變化的構型在不同的體系中發揮著不同的作用.UA和 OA唯一不同的是29-CH3.UA中位于19-C,而在 OA中位于20-C.在脂質過氧化和DNA鏈斷裂體系UA是最有效的化合物,然而OA是最弱的.所以-CH3,這個從未報道過有抗氧化作用的集團,其三維位置對其活性也有非常重要的影響.

本文結果顯示,三萜化合物的抗氧化作用機制復雜,羥基及-CH3的位置和數目都可能會影響其對DNA損傷的保護和抑制脂質過氧化的作用,因此三萜化合物的抗氧化機制仍需更深入的研究.

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Abstract:The antioxidative effects of seven triterpenoids separated from labiatae Isodon were examined by testing their protection against DNA damage in human peripheral blood mononuclear cells induced by H2O2,inhibition of lipid peroxidation and DNA strand breakage.These triterpenoids exerted variably protective effects in these systems.Ursolic acid has the strongest protective effects in all three systems.2α,3β,dihydroxy-urs-12-en-28-oid acid are effective in inhibiting lipid peroxidatian but weak in protection DNA strand breakage.It's isomer 2α,3α,23-trihydroxy-urs-12-en-28-oic-acid showed opposite actions.Oleanolic acid is only effective in DNA damage induced by H2O2in single cell.The relationship between antioxidations and structures are also discussed.

Key words:Triterpenoid;labiatae isodon;antioxdation;comet assay;lipid peroxidation;DNA strand breakage

Inhibitions of lipid peroxidation and protection of DNA damage by triterpenoids fromlabiatae Isodon

LIU Guoan,MIN Jianping,ZHANGJiajia,XIE Yaoqiang,DING Lan,YAN G Hong
（College of Life Science,Northwest Normal University,Lanzhou,730070）

Q946

A

1000-1190（2010）04-0629-04

2010-06-30.

國家自然科學基金項目（30960464）;甘肅省教育廳研究生導師項目（0901-05）;西北師范大學知識與科技創新工程項目（NWNU-KJCXGC-03-65）.

＊E-mail:liuguoan@nwnu.edu.cn.