光學比濁法血小板聚集試驗的標準化研究

李 濤,屈晨雪,王建中,袁家穎,張愛玉,龔 巖,汪 潤

(北京大學第一醫院檢驗科,北京100034)

血小板聚集廣泛應用于抗血小板藥物如阿司匹林[1],氯吡格雷[2]的治療監測。光學比濁法血小板聚集試驗是檢測血小板聚集功能的金標準[3-5]。然而此法影響因素多,明顯影響了結果的重復性和可靠性。同時,血小板聚集試驗尚無通用的質控品來對試驗全過程進行質量控制,這也是影響其重復性的原因之一。為此本研究擬從優化光學比濁法血小板聚集功能試驗的影響因素入手,探討血小板聚集試驗的標準化,并通過制備質控品和初步應用,探討血小板聚集試驗室內質量控制中應用質控品的潛在可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 健康志愿者128例,其中男性70例,女性58例,年齡27-67歲(平均47.8歲)。健康志愿者均無心腦血管、血液或呼吸系統疾病,無高血壓病史,近期無感染及服用各種抗血小板藥物的病史。冠心病患者180例,為北京大學第一醫院2009年4月-2010年2月收治并經冠脈造影術確診的患者,其中男性100例,女性80例,年齡43-73歲(平均56.6歲)。血小板聚集不良患者:血小板發生聚集后又明顯解聚的病例,共30例,男性16例,女性14例,年齡37-68歲(平均51.2歲)。健康志愿者及患者均采集空腹靜脈血,枸櫞酸鈉抗凝(109 mmol/L),3 h內處理完成試驗。

1.2 主要試劑和儀器 二磷酸腺苷(ADP,美國Sigma公司);花生四烯酸(AA,美國Sigma公司);二甲基亞砜(DMSO,美國Biomol公司);海藻糖(北京化學試劑公司);KX-21型血細胞分析儀(日本Sysmex公司);LBY-NJ4血小板聚集儀(北京普利生公司)。

1.3 方法

1.3.1 血小板聚集率測定 采集患者或健康志愿者空腹靜脈血,枸櫞酸鈉抗凝,離心制備富含血小板血漿(PRP),并計數,以160g離心10 min制備乏血小板血漿(PPP)。按儀器要求以PPP管透光度為100%,以PRP管初始透光度為0%,加入誘導劑,記錄血小板聚集曲線及最大聚集率。

1.3.2 離心條件選擇 選擇不同離心力和離心時間制備PRP,共計9種離心條件,分別為:100 g離心5 min,100g離心10 min,100 g離心15 min,160 g離心5 min,160 g離心10 min,160 g離心15 min,200 g離心 5 min,200 g離心10 min和200g離心15 min。測定并計算不同離心條件所得PRP的血小板濃度、體積、血小板數量及最大PAR。

1.3.3 血小板濃度選擇 用PPP把對應PRP中血小板濃度分別調為 100×109/L,150×109/L,200×109/L,250×109/L,300×109/L和350×109/L。以ADP(5μ mol/L)作為誘導劑,測定PAR。

1.3.4 誘導劑濃度選擇 PRP血小板濃度調至200×109/L,測定不同ADP濃度和不同AA濃度的PAR。ADP終濃度分別為 2.5、5、10、15和 20μ mol/L,AA 終濃度分別為 0.5、0.75、1.0、1.5 和2.0 g/L。

1.3.5 血小板聚集曲線分析 以ADP(5 μ mol/L)為誘導劑,測定并記錄3組樣本(對照組40例,冠心病組30例和血小板聚集不良組30例)的1 min、3 min、5min聚集率及最大聚集率和聚集曲線下面積。

1.3.6 不同FIB濃度與血小板最大聚集率的相關性 按聚集試驗反應體積300μ l計算,采用不同比例的血清和PPP將PRP調至血小板濃度為200×109/L,配成不同濃度的FIB。以ADP(5 μ mol/L)為誘導劑,測定最大 PAR。

1.3.7 冠心病患者FIB含量和PAR之間的相關性 選健康人50例和冠心病患者150例,以ADP(5μ mol/L)為誘導劑,分別檢測其血漿FIB含量和血小板最大聚集率。

1.3.8 血小板聚集質控品制備 取多名健康志愿者PRP,混勻后分為3份,①對照組:不加任何保護劑,每管1.5 ml分裝,至少10管。②DMSO組:用注射器向PRP中緩慢(＜1ml/min 注入DMSO使其終濃度達到5%,靜置10 min后每管1.5 ml分裝,至少10管。③DMSO+海藻糖組:PRP中加入DMSO(終濃度5%)和海藻糖(終濃度50 mmol/L),37℃水浴4小時后每管1.5 ml分裝,至少10管。三組在做好標記后同時放入-70℃低溫冰箱中,定期取出,37℃復融后測定其PAR。

1.3.9 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行統計分析,所有數據均以均值±標準差(±s)表示,選擇單因素方差分析法比較各組間差異,兩組間比較采用LSD分析法,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 離心條件的選擇 以分離出PRP體積＞500 μ l,血小板數量＞200×109/L且對PAR無影響為宜。最后選擇160 g、離心10 min為離心方法。

2.2 血小板濃度的選擇 隨著PRP中血小板濃度的增加,最大聚集率也增高。結果表明濃度過低(＜200×109/L)和過高(＞300×109/L)都會影響結果(P＜0.01),不能將血小板聚集功能缺陷和增強的患者區分開。最后選擇血小板聚集的終濃度為(200-250)×109/L較合適。

2.3 ADP濃度選擇 隨著ADP濃度增加,血小板最大聚集率增大。ADP濃度在5 μ mol/L(67.09±3.67)%,基本反映正常人血小板聚集功能,但又能檢測到ADP誘導的PAR減低或增高。

2.4 AA濃度選擇 隨著AA濃度的增大,PAR增高。選擇AA濃度為0.5g/L時(71.81±3.98)%,基本反映正常人血小板聚集功能,但又能檢測到AA誘導的PAR減低或增高。

2.5 血小板聚集曲線分析 冠心病組在1 min、3 min、5 min聚集率及最大聚集率和聚集曲線下面積明顯高于對照組(P＜0.05),也高于聚集不良組(P＜0.05),見表1;聚集不良組與對照組比較在1min,3min聚集率和最大聚集率之間差異無統計學意義(P＞0.05),但在5 min聚集率和曲線下面積間差異有統計學意義(P＜0.05)。

表1 不同疾病組血小板聚集曲線參數比較(±s)

表1 不同疾病組血小板聚集曲線參數比較(±s)

注:*與對照組比較,P＜0.05;△與冠心病組比較,P＜0.05

分組 例數(n) 1 min聚集率(%) 3 min聚集率(%) 5 min聚集率(%) 最大聚集率(%) 聚集曲線下面積對照組 40 37.93±8.00 58.50±6.30 62.70±8.46 67.85±5.65 14 529.3±1 325.49冠心病組 30 52.66±6.94* 71.09±5.00* 75.00±6.19* 79.65±4.57* 18 088.39±1 336.05*聚集不良組 30 39.77±7.32△ 57.24±12.11△ 32.04±10.72*△ 62.65±5.50△ 9 851.64±1 574.65*△

2.6 FIB濃度與血小板最大PAR的相關性 隨著FIB濃度的增加,最大PAR也增大。冠心病患者體內高FIB含量伴隨血小板聚集性增強,冠心病組和對照組之間最大PAR與FIB的比值(AFR)差異有統計學意義(P＜0.01),見表2.

表2 對照組與冠心病組間比較(±s)

表2 對照組與冠心病組間比較(±s)

注:*與對照比較,P＜0.01

分組 n FIB(g/L) 最大聚集率(%) 最大聚集率/FIB含量(AFR)對照組 50 3.21±0.50 64.90±4.62 20.57±2.50冠心病 150 4.44±0.32* 77.82±5.60* 17.57±0.91*

2.7 質控品結果 未加保護劑的質控品隨著保存時間的延長,聚集率明顯下降,基本失去了聚集性。DMSO組第1天至第6天聚集率基本穩定,第10d聚集率開始下降,與前6天比差異有統計學意義(P＜0.05),表明DMSO組在10 d后聚集率下降明顯。DMSO加海藻糖組在15 d內PAR差異無統計學意義(P＞0.05),表明此組血小板聚集功能保存較好。

3 討論

血小板聚集是血小板參與生理止血的重要環節。同時,在許多病理性血栓形成過程中血小板聚集功能也發揮著先導而關鍵的作用。因此,檢測血小板聚集功能臨床出血與血栓性疾病的診斷及療效監測有指導意義。光學比濁法血小板聚集試驗因其操作簡便、快速,易于掌握且經濟和實用,故最常用,并作為”金標準”試驗[3-5]。然而此法影響因素多且在不同實驗室中實際操作方法不同,導致實驗結果重復性差,可比性不強,極大地限制了其在臨床上的廣泛應用。此外,試驗結果用最大PAR表示最為常用,但并不能完全反映血小板在誘導劑作用下聚集的反應性和全過程,尤其是對于聚集后發生解聚的標本更是如此。由于本試驗是測定采血后新鮮血漿中的血小板,因此該試驗一直沒有找到可以控制其精密度的室內質控物,使測定結果的準確性沒有可靠的保證。為此本研究從優化血小板聚集功能試驗的影響因素入手,探討血小板聚集試驗的標準化,從而為臨床提供更加準確的資料。

光學比濁法的血小板聚集試驗需要首先進行制備PRP,本研究根據文獻和臨床實際應用觀察了9種不同離心條件對血小板聚集試驗的影響,結果未發現這9中離心方法對PAR有顯著影響(P＞0.05),但對分離出的PRP體積,血小板濃度和血小板總數確有較大影響。本研究對是否需要調整血小板濃度也進行了探討,結果發現血小板濃度的確對最大聚集率有影響,濃度過低會使聚集率減小,我們推薦血小板濃度調整為(200-250)×109/L,較為適宜,使血小板聚集試驗測定結果穩定,也有助于增加室間的可比性。

臨床上血小板聚集試驗結果普遍使用最大PAR表示,但即使最大PAR相同,聚集曲線也可能是顯著不一致,其臨床意義也不完全相同。本研究通過比較分析對照、冠心病和血小板聚集不良三組患者 1 min、3 min、5 min的PAR及最大PAR和聚集曲線下面積發現,冠心病患者各個指標均高于對照組;而血小板聚集不良組患者其最大PAR雖與對照組無差異,但5min聚集率和曲線下面積確顯著低于降低,這是因為血小板聚集后發生明顯解聚所致,提示血小板聚集性不穩定。因此,采用最大聚集率和聚集曲線下面積兩種表達方式可能更準確的反應血小板聚集功能。

血小板聚集功能的發揮主要依靠其表面膜糖蛋白和血漿中的FIB。本研究通過調節血漿FIB濃度觀察PAR的變化,結果顯示二者呈現正相關。進一步分析發現冠心病組最大PAR和血漿FIB濃度高于對照組,最大PAR與FIB含量的比值(AFR)顯著低于對照組,表明冠心病患者最大PAR增大與患者FIB濃度顯著增高相關[6]。在臨床觀察到冠心病等血栓性疾病患者最大PAR伴FIB濃度增高,且AFR降低時,提示FIB是導致其血小板聚集增高的主要因素;在抗血小板治療時,除服用血小板聚集抑制劑外,聯合服用降FIB含量的藥物可能會起到更好的抗栓效果。故建議在報告血小板最大聚集率的同時,報告AFR,可能更有助于選擇合適的藥物,提高療效。

血小板聚集試驗尚無國際或國內通用的質控品,其原因可能是因為在血小板保存過程中血小板數量、形態、生化和細胞功能均會發生變化,這種變化稱為”保存損傷”[7]。本研究發現加入DMSO和海藻糖兩種保護劑的質控品,至少在15d內其最大PAR能穩定;但使用保護劑后,冰凍血小板的聚集性仍低于新鮮血小板,說明保護劑不能對血小板起到完全的保護作用。

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[6]Alan D.Michelson.Platelet Function Testing in Cardiovascular Diseases[J].Circulation,2004,110;e489.

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