石榴皮萃取物對(duì)番茄灰霉病菌抑制作用及防病效果

喬樹(shù)華, 蔣紅云, 張燕寧, 何偉志

(植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,北京 100193)

番茄灰霉病(Botrytiscinerea Pers.)是設(shè)施栽培番茄上的一種重要病害,從20世紀(jì)80年代以來(lái),隨著我國(guó)保護(hù)地蔬菜種植面積不斷擴(kuò)大,該病害成為番茄生產(chǎn)的限制性障礙[1]。番茄灰霉病菌菌絲在5～30℃均可生長(zhǎng),孢子在8～32℃均可萌發(fā)[2],所以適宜生長(zhǎng)的機(jī)會(huì)大,危害也大,尤其在我國(guó)北方蔬菜區(qū)是一種危害性很大的病害。塑料大棚、溫室、小拱棚等保護(hù)設(shè)施栽培的番茄常發(fā)生灰霉病的流行,嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)達(dá)30%以上。我國(guó)南方蔬菜區(qū)過(guò)去較少發(fā)生此病,但近年來(lái)由于保護(hù)設(shè)施栽培的發(fā)展,番茄灰霉病也開(kāi)始發(fā)生并有逐年加重趨勢(shì)。目前主要依靠化學(xué)防治。但由于化學(xué)藥劑的連續(xù)使用,使病原菌產(chǎn)生了抗藥性,防效逐年降低,也造成了一定的農(nóng)藥污染。隨著人們環(huán)保意識(shí)的提高,對(duì)無(wú)公害蔬菜的需求越來(lái)越大。因此,近年來(lái),開(kāi)發(fā)低毒、低殘留的植物源農(nóng)藥成為無(wú)公害農(nóng)藥研究的熱點(diǎn)之一。

本研究對(duì)石榴皮的萃取物抑制番茄灰霉病菌的菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)進(jìn)行了測(cè)試。同時(shí)報(bào)道了石榴皮萃取物對(duì)番茄灰霉病的溫室盆栽防治試驗(yàn)結(jié)果。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

石榴皮(Punica granatum),購(gòu)于北京同仁堂藥店。

番茄灰霉病菌(Botry tis cinerea),由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所農(nóng)業(yè)有害生物基本調(diào)查創(chuàng)新研究組提供。

供試番茄品種為粉紅番茄合作908(上海番茄研究所)。

70%甲基硫菌靈可濕性粉劑(西安常隆正華作物保護(hù)有限公司)。

乳化劑0204,由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所農(nóng)藥研究室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

采用超聲波提取法。將石榴皮放入50℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干至發(fā)脆,用植物粉碎機(jī)(河南滎陽(yáng)市三張機(jī)械廠生產(chǎn))將其粉碎,過(guò) 40目篩。稱取500 g,用溶劑浸提3次,過(guò)濾,合并3次提取液。將其分幾次轉(zhuǎn)入500 m L或1 000 m L圓底磨口燒瓶中,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā),溫度70℃,壓強(qiáng)0.080～0.095M pa,蒸發(fā)至沒(méi)有回流液,油膏狀為止。

采用液液分配萃取的方法得到萃取物。

稱取50 g的石榴皮甲醇提取物,用4倍量的蒸餾水溶解,然后用極性不同的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇溶劑對(duì)所得浸膏進(jìn)行連續(xù)等量的萃取,減壓濃縮得石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取物浸膏,分別稱重后放入4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 室內(nèi)試驗(yàn)

1.3.1 石榴皮萃取物對(duì)番茄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

參照陳年春[3]的生長(zhǎng)速率測(cè)定法進(jìn)行。

將各萃取物配成 200、100、50、25、12.5 g/L 5個(gè)濃度梯度。每個(gè)處理重復(fù)3次,以平皿中加入蒸餾水作為空白對(duì)照。于(26±1)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待對(duì)照皿中菌落長(zhǎng)至培養(yǎng)皿邊緣時(shí)調(diào)查菌落直徑(菌落直徑平均值-4)。計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率,求出毒力回歸方程、EC50和95%置信限。

1.3.2 石榴皮萃取物對(duì)灰霉病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

參照陳年春[3]孢子萌發(fā)試驗(yàn)法進(jìn)行。

在25℃下培養(yǎng)3 d的供試菌種中加入滅菌水5 m L,用接種針輕輕摩擦培養(yǎng)基表面,使孢子懸浮于水中,用紗布過(guò)濾去掉培養(yǎng)基塊及菌絲體;或者在孢子懸浮于水中后,靜置片刻,取上清液,鏡檢每視野中含孢子80～100個(gè)作為菌原材料。將各萃取液和孢子懸浮液等量混合,將混合液用移液管滴入凹玻片的凹槽內(nèi),置于培養(yǎng)皿中(培養(yǎng)皿中鋪吸水紙并加無(wú)菌水濕潤(rùn),以便保濕),在25～27℃恒溫下培養(yǎng)使孢子萌發(fā),3～4 h后檢查孢子萌發(fā)率。每一處理重復(fù)3次,并以不加藥劑的孢子懸浮液為對(duì)照。

1.4 盆栽試驗(yàn)

1.4.1 石榴皮萃取物對(duì)番茄灰霉病的保護(hù)效果

將石榴皮萃取物先加入5%乳化劑0204增加其乳化性,再用蒸餾水稀釋100、300倍,于番茄植株葉面噴施,24 h后,用3%的蔗糖溶液制備孢子懸浮液(約1×105個(gè)/m L)接種,接種后保濕。每處理3次重復(fù),每個(gè)重復(fù)3盆番茄植株。以噴灑蒸餾水作為空白對(duì)照,以70%甲基硫菌靈可濕性粉劑300倍作為化學(xué)藥劑對(duì)照。15～21 d后觀察記錄葉片發(fā)病級(jí)數(shù),并計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。

1.4.2 石榴皮萃取物對(duì)番茄灰霉病的治療作用

在盆栽番茄上分別接種番茄灰霉病病菌,保濕24 h,然后噴施石榴皮萃取物稀釋100、300倍液。每處理3次重復(fù),每個(gè)重復(fù)3盆番茄植株,以噴灑蒸餾水作為空白對(duì)照,以70%甲基硫菌靈可濕性粉劑300倍處理作為化學(xué)藥劑對(duì)照[5]。15～21 d后觀察記錄葉片發(fā)病級(jí)數(shù),并計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。

病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下[4]。

0級(jí):無(wú)病斑;

1級(jí):病斑面積占整個(gè)葉面積5%以下;

3級(jí):病斑面積占整個(gè)葉面積6%～10%;

5級(jí):病斑面積占整個(gè)葉面積11%～20%;

7級(jí):病斑面積占整個(gè)葉面積21%～50%;

9級(jí):病斑面積占整個(gè)葉面積50%以上。

病情指數(shù)=(∑各級(jí)病葉數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值)×100/調(diào)查總?cè)~數(shù)×9;

防治效果=(CK-PT)/CK×100%;

式中:CK—空白對(duì)照施藥后病情指數(shù);

PT—藥劑處理施藥后病情指數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)結(jié)果用M icroso ft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理,經(jīng)DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 石榴皮萃取物對(duì)番茄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

以生長(zhǎng)速率法測(cè)定了石榴皮萃取物對(duì)番茄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果(表1)表明,正丁醇萃取物對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制活性最強(qiáng),其EC50為50.28 g/L;石油醚萃取物次之,EC50為66.16 g/L。

4種萃取物的毒力測(cè)定結(jié)果顯示,抑制活性大小依次為正丁醇萃取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和氯仿萃取物。表明極性較大的正丁醇萃取物對(duì)黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)有顯著的抑制作用。

2.2 石榴皮萃取物對(duì)灰霉病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

石榴皮萃取物對(duì)番茄灰霉病菌孢子萌發(fā)的抑制作用見(jiàn)圖1。石榴皮萃取物各處理均表現(xiàn)出對(duì)孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用。正丁醇萃取物抑制活性最高,各個(gè)不同處理表現(xiàn)出顯著差異。結(jié)果表明石榴皮萃取物對(duì)番茄灰霉病菌的孢子萌發(fā)具有顯著抑制作用。這種抑制作用與濃度呈正相關(guān)關(guān)系。

2.3 石榴皮萃取物對(duì)番茄灰霉病的保護(hù)作用及治療作用

在溫室盆栽番茄上測(cè)定了石榴皮正丁醇萃取物對(duì)番茄灰霉病的保護(hù)和治療作用,結(jié)果見(jiàn)表2。正丁醇萃取物對(duì)番茄灰霉病具有顯著的防治效果,其100倍液對(duì)番茄灰霉病的保護(hù)效果達(dá)到46.41%,治療作用效果達(dá)到48.00%,均與對(duì)照化學(xué)藥劑甲基硫菌靈300倍處理達(dá)到同一顯著水平。

表1 石榴皮萃取物對(duì)番茄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

圖1 石榴皮萃取物對(duì)番茄灰霉病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

表2 石榴皮正丁醇萃取物對(duì)番茄灰霉病的溫室防治效果

3 結(jié)論與討論

采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定石榴皮萃取物對(duì)番茄灰霉病菌菌絲的抑制作用,結(jié)果表明,正丁醇萃取物抑菌活性最強(qiáng),培養(yǎng)過(guò)程中,前期抑菌效果好于后期,可能是活性成分隨時(shí)間延長(zhǎng)有所降解。

孢子萌發(fā)法測(cè)定結(jié)果表明,石榴皮萃取物對(duì)孢子萌發(fā)均表現(xiàn)出顯著的抑制活性。

在溫室試驗(yàn)中,正丁醇萃取物對(duì)番茄灰霉病也表現(xiàn)出顯著的防治效果,其100倍液對(duì)番茄灰霉病的保護(hù)效果為46.41%,治療效果達(dá)到48.00%。

在本試驗(yàn)中,試驗(yàn)材料為植物萃取液粗提物,濃度較高,可能是由于純度不夠,導(dǎo)致用藥量過(guò)大。考慮到溫室栽培條件下番茄結(jié)果比較困難,因而在溫室試驗(yàn)中,選用番茄葉片作為試驗(yàn)靶標(biāo)。而石榴皮萃取物對(duì)番茄果實(shí)灰霉病的防治效果如何,需進(jìn)一步進(jìn)行田間試驗(yàn)驗(yàn)證。

[1] 李寶聚,朱國(guó)仁,關(guān)天舒,等.節(jié)能日光溫室中番茄灰霉病發(fā)生規(guī)律的研究[J].植物保護(hù),2003,29(2):26-29.

[2] 馬輝剛,李瑞明,胡水秀,等.番茄灰霉病菌生物學(xué)特性研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1998,20(2):801-803.

[3] 陳年春.農(nóng)藥生物測(cè)定技術(shù)[M].北京:北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1990:135-165.

[4] 農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所生測(cè)室.農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則(一)[M].中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,1993:47-48.

[5] 王樹(shù)桐,曹克強(qiáng),胡同樂(lè),等.中藥細(xì)辛提取物對(duì)番茄灰霉病菌的抑菌作用及防病效果研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,29(1):5-8.