小葉板藍(lán)根抗病毒及抑菌效果比較研究

謝曉亮，尹曉琳，溫春秀，劉靈娣

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院藥用植物研究中心，河北 石家莊 050051；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050071）

小葉板藍(lán)根抗病毒及抑菌效果比較研究

謝曉亮1*，尹曉琳2，溫春秀1，劉靈娣1

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院藥用植物研究中心，河北 石家莊 050051；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050071）

目的：明確不同板藍(lán)根種質(zhì)藥效學(xué)差別，為板藍(lán)根優(yōu)良品種選育、生產(chǎn)栽培提供依據(jù)。方法：通過(guò)板藍(lán)根不同種質(zhì)水提液細(xì)胞毒試驗(yàn)、抗病毒試驗(yàn)、抑菌試驗(yàn)，進(jìn)行抗病毒、抑菌效果比較。結(jié)果：小葉板藍(lán)根對(duì)細(xì)胞的毒性作用、抗病毒作用以及對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用均明顯優(yōu)于大葉板藍(lán)根，從藥效學(xué)監(jiān)督看小葉板藍(lán)根可以作為板藍(lán)根栽培的優(yōu)良品種進(jìn)行推廣應(yīng)用。

板藍(lán)根；種質(zhì)；抗病毒；抑菌；比較研究

板藍(lán)根是我國(guó)傳統(tǒng)常用中藥材， 《中國(guó)藥典》2010年版記載板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigoticaFort.的干燥根，別名北板藍(lán)、大青根等，其葉為大青葉。板藍(lán)根味苦，性寒，歸心、胃經(jīng)，具有清熱解毒，涼血利咽的功能［1］，具有抗菌、抗病毒、抗內(nèi)毒素、抗炎、增強(qiáng)免疫功能［2-3］、抗乙型肝炎［4］等多種作用。近年來(lái)的研究證實(shí)，板藍(lán)根內(nèi)含有多種抗病毒成分，對(duì)感冒病毒、腮腺炎病毒、肝炎病毒及流腦病毒等有較強(qiáng)的抑制和殺滅作用［5-8］，主治流行性感冒、流行性腮腺炎、乙型腦炎、傳染性肝炎、咽喉腫痛等癥［9-11］。它是板藍(lán)根沖劑、板藍(lán)根針劑、三九感冒靈、康必得等感冒和抗病毒類中成藥的主要原料。在臨床上常用板藍(lán)根單味或與貫眾、金銀花、野菊花等合用以治療感冒和流感等傳染病及熱性病。然而，板藍(lán)根種質(zhì)混雜，栽培類型較多。目前，安國(guó)等地大田生產(chǎn)的板藍(lán)根有明顯區(qū)別的兩種類型，一是小葉菘藍(lán)，習(xí)稱北板藍(lán)根（小葉板藍(lán)根）；一是廣泛栽培的大葉菘藍(lán)（大葉板藍(lán)根，普通栽培品）。本文針對(duì)目前安國(guó)等地種植生產(chǎn)的小葉板藍(lán)根和大葉板藍(lán)根進(jìn)行了抑菌及抗病毒效果方面的比較研究，明確其藥效學(xué)差別，為生產(chǎn)栽培提供依據(jù)。

1 材料

小葉板藍(lán)根和對(duì)照大葉板藍(lán)根均采自安國(guó)霍莊種植基地。取1年生秋季采收的根條，切成1 cm左右長(zhǎng)的小塊于60℃烘箱中過(guò)夜烘干至衡重，然后將其粉碎，取其粉末分別裝袋編號(hào)，置干燥器中備用。

稱取制備好的板藍(lán)根粉末10 g，加蒸餾水80mL于100 mL燒杯中煮至沸騰，并繼續(xù)煮沸水提15 min，室溫下冷卻后于 2 000 r·min－1下離心10 min，取上清液用5 mol·L－1NaOH水溶液調(diào)pH值至7.2，于100 mL容量瓶中定容得板藍(lán)根水提制劑原液置4℃冰箱中備用。

病毒唑（上海通用藥業(yè)股份有限公司第三公司）；1640培養(yǎng)液（GIBCO公司）；FBS（胎牛血清，杭州四季青生物工程有限公司）；慶大霉素（Sigma公司）；Hela細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）；金黃色葡萄球菌ATCC26001（北京菌種保存中心）；MH血液瓊脂培養(yǎng)基（自配）；呼吸道合胞病毒（RSV）（中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院）。

2 方法

2.1 藥液配制

細(xì)胞維持液（2%FBS1640培養(yǎng)液）：98 mL 1640培養(yǎng)液、2mL FBS（胎牛血清）、0.125 mL慶大霉素（4萬(wàn) U·mL－1），混勻過(guò)濾除菌備用。

病毒唑溶液配制：取病毒唑溶液（100 mg·mL－1）0.6 mL，加入0.6mL，混勻后用細(xì)胞維持液進(jìn)行倍比稀釋，稀釋的終濃度分別為 1／4，1／8，1／16，1／32，1／64，1／128，1／256，1／512，1／1 024（即配即用）。

各種板藍(lán)根制劑的配制：取定容后的板藍(lán)根水提制劑原液0.6 mL，加入0.6 mL細(xì)胞維持液進(jìn)行倍比稀釋，得到終濃度為原液濃度的1／4，1／8，1／16，1／32，1／64，1／128，1／256，1／512，1／1 024的板藍(lán)根水提制劑稀釋液（即配即用）。

2.2 細(xì)胞毒試驗(yàn)

取出凍存的Hela細(xì)胞，立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1 min內(nèi)全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。每2 d擴(kuò)增1次細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)足量時(shí)，將細(xì)胞稀釋成1×106個(gè)·mL－1，分裝至 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，1 mL／孔，同樣條件過(guò)夜培養(yǎng)。

將生長(zhǎng)良好的24孔單層細(xì)胞培養(yǎng)板用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌1次細(xì)胞，然后加入各濃度板藍(lán)根水提制劑稀釋液及病毒唑，1 mL／孔，每個(gè)稀釋度用兩個(gè)孔，留細(xì)胞對(duì)照，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，通過(guò)顯微鏡下觀察有無(wú)細(xì)胞病變來(lái)確定不同藥物的細(xì)胞毒性。

2.3 抗病毒試驗(yàn)

將擴(kuò)增好的RSV病毒液進(jìn)行10倍系列稀釋，取10－3和10－4兩個(gè)濃度的病毒稀釋液接種于新的生長(zhǎng)良好的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的單層Hela細(xì)胞中，每孔0.1 mL，每個(gè)稀釋度接種2孔，37℃、5%CO2下孵育1 h，棄病毒液。

將2種板藍(lán)根的水提制劑原液和病毒唑溶液（100 mg·mL－1）進(jìn)行倍比稀釋。取 1／64～1／1 024的5個(gè)稀釋度進(jìn)行病毒抑制試驗(yàn)，其中小葉板藍(lán)根和大葉板藍(lán)根從1／32開始，病毒唑從1／128開始稀釋。將以上幾種藥液分別加入不同稀釋度病毒吸附過(guò)的單層Hela細(xì)胞中，每個(gè)稀釋度各加2孔，同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照、細(xì)胞對(duì)照，置37℃、5%CO2下培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀察有無(wú)細(xì)胞病變。

2.4 抑菌試驗(yàn)

將金黃色葡萄球菌ATCC26001接種于M-H血液瓊脂平板中，37℃普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。

將金黃色葡萄球菌配制成105CFU·mL－1，接種于含藥 1／2，1／4，1／8，1／16，1／32，1／64，1／128，1／256，1／512的液體 M-H培養(yǎng)基中，50μL／管，37℃下培養(yǎng)24 h，并設(shè)正常對(duì)照。

取培養(yǎng)后的各稀釋度菌液做百倍稀釋，得10－2，10－4，10－6，10－85個(gè)稀釋度，再取百倍稀釋的各稀釋度菌液50μL，分別涂布在不含藥液的M-H固體培養(yǎng)板上，培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果。

菌落計(jì)數(shù)：菌落計(jì)數(shù)后，按 “細(xì)菌濃度＝菌落數(shù)／0.05 mL×稀釋倍數(shù)”折算出各管細(xì)菌的濃度。

3 結(jié)果與分析

3.1 小葉板藍(lán)根對(duì)細(xì)胞的毒性

24孔單層細(xì)胞培養(yǎng)板上生長(zhǎng)良好的細(xì)胞經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌1次并加入各濃度板藍(lán)根水提制劑稀釋液及病毒唑后，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，然后在顯微鏡下觀察有無(wú)細(xì)胞病變發(fā)生。未發(fā)生病變的細(xì)胞應(yīng)為梭形，發(fā)生病變的細(xì)胞變?yōu)閳A形或多形態(tài)性。結(jié)果以出現(xiàn)明顯病變的稀釋度（＋）為最高稀釋度，見表1。由表1可以看出，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用的最高稀釋度：小葉板藍(lán)根為1／32，大葉板藍(lán)根為1／16，藥物陽(yáng)性對(duì)照（病毒唑）為1／64。顯然各種板藍(lán)根的細(xì)胞毒性與病毒唑相比均較弱，其中小葉板藍(lán)根對(duì)細(xì)胞的毒性作用強(qiáng)于大葉板藍(lán)根。

表1 小葉板藍(lán)根的細(xì)胞毒試驗(yàn)比較

3.2 小葉板藍(lán)根的抗病毒效果

將小葉板藍(lán)根和對(duì)照大葉板藍(lán)根的水提制劑原液和病毒唑溶液（100 mg·mL－1）進(jìn)行2倍稀釋。取1／64～1／1 024的5個(gè)稀釋度進(jìn)行病毒抑制試驗(yàn)，其中大葉板藍(lán)根從1／32開始，病毒唑從1／128開始稀釋。將以上幾種藥液分別加入10－3和10－4兩種不同稀釋度的病毒吸附過(guò)的單層Hela細(xì)胞中，同病毒對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照一起，在37℃、5%CO2下培養(yǎng)48h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞發(fā)生病變的情況，確定細(xì)胞是否發(fā)生病變，病變的標(biāo)準(zhǔn)同前，觀察結(jié)果見表2和表3。從中不難看出，當(dāng)病毒稀釋度為10－4時(shí)，藥物抗病毒作用的最高稀釋度：小葉板藍(lán)根為1／512，大葉板藍(lán)根為1／128，陽(yáng)性對(duì)照（病毒唑）為1／256，可見在此病毒稀釋度下，小葉板藍(lán)根的抗病毒效果是大葉板藍(lán)根的4倍；當(dāng)病毒稀釋度為10－3時(shí)，藥物抗病毒作用的最高稀釋度：小葉板藍(lán)根為1／256，大葉板藍(lán)根為1／32，陽(yáng)性對(duì)照（病毒唑）為1／128。可見，在此病毒稀釋度下，小葉板藍(lán)根的抗病毒效果是大葉板藍(lán)根的8倍，而且同樣也是病毒唑的2倍。兩種病毒稀釋度的結(jié)果均表明，小葉板藍(lán)根的抗病毒作用效果明顯比大葉板藍(lán)根強(qiáng)，且均強(qiáng)于病毒唑的抗病毒效果。

表2 小葉板藍(lán)根抗病毒作用比較（RSV 10－4）

表3 小葉板藍(lán)根抗病毒作用比較（RSV 10－3）

3.3 小葉板藍(lán)根對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用

取培養(yǎng)后的各稀釋度金黃色葡萄球菌菌液做百倍稀釋，得 10－2，10－4，10－6，10－84個(gè)稀釋度，再取百倍稀釋的各稀釋度菌液50μL，分別涂布在不含藥液的M-H固體培養(yǎng)板上，經(jīng)24 h培養(yǎng)后觀察結(jié)果，并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并計(jì)算出最終細(xì)菌濃度，見表4。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌作用，小葉板藍(lán)根有 4個(gè)稀釋度（1／16，1／8，1／4和1／2）表現(xiàn)明顯的抑菌效果，而大葉板藍(lán)根僅有3個(gè)稀釋度（1／8，1／4和1／2）有明顯抑菌效果。小葉板藍(lán)根在稀釋度為1／16時(shí)即表現(xiàn)抑菌作用，1／8濃度時(shí)作用變強(qiáng)，1／4和1／2濃度時(shí)抑菌作用同大葉板藍(lán)根相比最為明顯，特別是1／4稀釋度下，小葉板藍(lán)根的抑菌效果是大葉板藍(lán)根的106，即100萬(wàn)倍。由此可見對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌作用，小葉板藍(lán)根要明顯強(qiáng)于大葉板藍(lán)根。

表4 小葉板藍(lán)根對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用比較

4 討論

試驗(yàn)通過(guò)對(duì)小葉板藍(lán)根與普通栽培種大葉板藍(lán)根的細(xì)胞毒、抗病毒、抑菌效果比較研究表明，小葉板藍(lán)根與大葉板藍(lán)根的抗菌、抗病毒活性不同，這與劉云海等［10］、喬傳卓等［11］的研究報(bào)道一致。本試驗(yàn)結(jié)果表明小葉板藍(lán)根對(duì)細(xì)胞的毒性作用明顯強(qiáng)于大葉板藍(lán)根；小葉板藍(lán)根的抗病毒作用效果明顯比大葉板藍(lán)根強(qiáng)；對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌作用，小葉板藍(lán)根強(qiáng)于大葉板藍(lán)根。從藥效學(xué)角度看，小葉板藍(lán)根可作為優(yōu)良板藍(lán)根種質(zhì)進(jìn)行推廣應(yīng)用。

表2和表3的抗病毒作用結(jié)果顯示，小葉板藍(lán)根的水提液與大葉板藍(lán)根的水提液在兩個(gè)病毒稀釋度下的抗病毒表現(xiàn)趨勢(shì)一致，當(dāng)病毒稀釋度為10－4時(shí)，藥物抗病毒作用的最高稀釋度：小葉板藍(lán)根為1／512，大葉板藍(lán)根為1／128，在此病毒稀釋度下，小葉板藍(lán)根的抗病毒效果是大葉板藍(lán)根的4倍；當(dāng)病毒稀釋度為10－3時(shí)，藥物抗病毒作用的最高稀釋度：小葉板藍(lán)根為1／256，大葉板藍(lán)根為1／32，在此病毒稀釋度下，小葉板藍(lán)根的抗病毒效果是大葉板藍(lán)根的8倍，也就是說(shuō)，投入等量的藥材量，小葉板藍(lán)根的藥效是大葉藥效的4倍以上。

表4顯示，小葉板藍(lán)根對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌作用，其水提液稀釋度由1／8變?yōu)?／16時(shí)，抗菌效果下降僅10倍左右，而由1／4變?yōu)?／8時(shí)則下降了近106即100萬(wàn)倍。而接下來(lái)由1／2變?yōu)?／4時(shí)抗菌效果則又僅僅下降了不到100倍。我們認(rèn)為，水提液稀釋度由1／2變?yōu)?／4時(shí)抗菌效果下降幅度的大幅度減小與試驗(yàn)溶液中金黃色葡萄球菌的濃度有關(guān)，并非是抗菌效果下降的幅度真的變小了，也就是說(shuō)這種結(jié)果出現(xiàn)的真正原因可能是某種因素在起作用，本研究沒(méi)有進(jìn)行進(jìn)一步的探討。

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A Com parative Study on Effects of Antivirus and Bacteriostasis of Different Germ plasms of Isatidis Radix

Xie Xiaoliang1，Yin Xiaolin2，Wen Chunxiu1，Liu Lingdi1
（1.Research Center on Medicinal Plants Hebei Agriculture and Forestry Academy，Shijiazhuang Hebei050051，China；2.College of Basic Medicine HebeiMedical University，Shijiazhuang Hebei050071，China）

Objective：The pharmacodynamics differences in different germplasms of isatidis radix were studied to provide basis for the field production.Methods：The water extracts from the germplasms of isatidis radix were used in cytotoxicity test，antivirus and antibacterial tests.Results：It was found that toxicity to cells，antivirus and bacteriostasis effects toward golden staphylococci of small leaf isatidis radix were obviously stronger than those of the big leaf one，the small leaf one should be used in production as an improved variety of isatidis radix.

Isatidis radix；Germplasm；Antivirus；Bacteriostasis；Comparative study

*謝曉亮，E-mail：xie7652137＠126.com

2010-03-16）