不同培養條件對牛膝發根誘導的研究

畢博，徐大衛，聞玉麗，劉亞磊，楊世海*，林悅

（1.吉林農業科技學院教務處，吉林 吉林 132109；2.中國藥材公司，北京 100195；3.吉林農業大學中藥材學院，吉林 長春 130118；4.河北醫科大學基礎課教學部，河北 石家莊 050091）

不同培養條件對牛膝發根誘導的研究

畢博1，徐大衛2，聞玉麗3，劉亞磊4，楊世海3*，林悅4

（1.吉林農業科技學院教務處，吉林 吉林 132109；2.中國藥材公司，北京 100195；3.吉林農業大學中藥材學院，吉林 長春 130118；4.河北醫科大學基礎課教學部，河北 石家莊 050091）

目的：利用發根農桿菌A4，R1，1601，1025誘導牛膝，得到發根。方法：采用共培養法誘導牛膝發根，研究不同菌種類型、不同外植體、不同浸染時間、乙酰丁香酮濃度等條件對轉化率的影響。結果：利用發根農桿菌1025浸染牛膝的葉片為轉化材料，當感染8min，轉化率最高。在培養基中添加50μmol·L－1乙酰丁香酮可以提高牛膝發根的轉化效率。結論：用共培養法誘導出牛膝發根，并確定了最佳誘導條件，以提高牛膝外植體的誘導率。

牛膝；發根農桿菌；發根；誘導率

牛膝Achyranthes bidentataBl.是莧科牛膝屬植物，主產河南省焦作市沁陽、武陟、溫縣一帶［1］。其根具有逐瘀通經，補肝腎，強筋骨，利尿通淋，引血下行的功能［2］。藥理研究表明，懷牛膝所含的多糖、皂元齊墩果酸、蛻皮激素等有效成分具有消炎、利尿、強心、抑制S180瘤株生長及抗生育作用［3，4］。中藥牛膝屬多年生草本植物，生長緩慢，不能滿足市場需求，而發根農桿菌在植物遺傳改造上有明顯的增強次生代謝的作用，近年來，應用Ri質粒轉化藥用植物的研究越來越受到重視［5，6］。本試驗采用發根農桿菌誘導牛膝外植體，成功得到了牛膝發根，為建立牛膝工業化生產的新途徑提供了一個參考方法。

1 材料與方法

1.1 植物材料

牛膝AchyranthesbidentataBl.種子，采自吉林農業大學藥植園，經吉林農業大學中藥材學院楊世海教授鑒定。

1.2 牛膝無菌苗的獲得

挑選成熟飽滿的牛膝種子，用無菌水清洗3次，然后用75%乙醇消毒30s后，用無菌水清洗3次；用0.1%HgCl浸泡10min之后，用無菌水清洗3次，再用無菌濾紙將種子表面的水分吸干，將種子接種到MS培養基中。于溫度25℃，光強2 000lx、光照12h·d－1條件下萌發，見圖1。

圖1 牛膝無菌苗

1.3 發根農桿菌的活化

無菌條件下，接種針挑取保存菌液，于YEB固體平板上劃線培養，28℃放置于暗培養條件下培養，直到長出單菌落。挑取一個單菌落接種于20mL附加有Kan（50mg·L－1）的液體YEB培養基，28℃，搖床搖速180r·min－1條件下培養24h復蘇。此時YEB液體培養基由接種前的透明的紅棕色變成渾濁的淡黃色，證明細菌已正常長出。長出的菌液還要進行再次活化，活化時取1mL復蘇菌液加入50mL的YEB液體培養基中，28℃，180r·min－1培養12h，活化菌液達到生長對數期，此時菌液即可作為感染用。

1.4 牛膝發根的誘導

在無菌條件下將牛膝無菌苗的幼嫩葉片剪成1cm2大小的片段，莖段長約1cm，每個樣品的MS固體培養基上接種10片，每個樣品重復3次，黑暗中25℃下預培養2d。在超凈工作臺上將預培養2d后的葉片轉移至已滅菌的錐形瓶，再將活化好的感染菌液倒入其中，感染時間8min。感染過程中需不斷輕輕搖晃錐形瓶，然后用無菌濾紙吸干葉片表面菌液，接種到含AS的MS固體平板培養基中，于25℃黑暗條件下共培養2d，再將感染材料用無菌水清洗3次，用無菌濾紙吸干葉片表面的水，轉接到含有Cef（500mg·L－1）的MS固體平板培養基上，于25℃黑暗條件下培養，每7d轉接1次，30d后統計誘導出的發根數，并計算平均誘導率。

2 結果與分析

2.1 不同發根農桿菌對牛膝發根誘導率的影響

由于不同發根農桿菌菌株對牛膝莖葉誘導率的影響程度不同，采用共培養法來比較牛膝莖葉對四種發根農桿菌A4，R1，1601，1025的敏感程度，誘導率統計結果見表1。

表1 不同發根農桿菌對發根誘導率的影響

表1數據顯示，4種發根農桿菌A4，R1，1601，1025對牛膝外植體都有一定的誘導作用，其中經過A4浸染的牛膝外植體誘導率最低，只有40%，其次為R1，1601，誘導率最高的是1025，達到了70%。由此可知，牛膝對發根農桿菌1025最為敏感，1025為最適菌株。不同菌株類型對發根誘導率影響效果見圖2。

圖2 4種不同菌株類型對發根誘導率的影響

2.2 不同外植體對牛膝發根誘導率的影響

利用發根農桿菌1025，采用共培養法對牛膝外植體進行感染發現，選用的外植體不同，發根的誘導率也不同，結果見表2。

表2 不同外植體對發根誘導率的影響

由表2數據可以看出，牛膝葉片的誘導率比較高，達到76.67%，而莖段的誘導率相對較低，但是差別不是很明顯。因此，實驗中選用牛膝葉片作為外植體。

2.3 不同濃度乙酰丁香酮對誘導發根的影響

植物受傷后產生的酚類物質能激活Vir基因，促使質粒向植物細胞轉移，在轉化系統中加入某種酚類物質可以促進基因轉化。目前廣泛使用的是乙酰丁香酮（AS）和羥基乙酰丁香酮（OH-AS），已取得了良好效果。由于不同濃度AS對牛膝發根的誘導程度不同，在MS培養基中分別加入0，25，50，75，100mg·L－1的AS培養，誘導率都有所提高，結果見表3。

表3 乙酰丁香酮對發根的影響

由表3可知，在本實驗中，加入AS后發根誘導率有所提高，效果比較明顯，但是在加入100μmol·L－1時，外植體大部分死亡，反而使其誘導率大大下降。50μmol·L－1的AS最適合牛膝發根的誘導，誘導率可達到90%。AS對發根誘導率的影響效果見圖3。

圖3 AS對發根誘導率的影響

2.4 不同浸染時間對發根誘導率的影響

浸染時間對于誘導率的高低也有直接的影響。適宜的浸染時間有助于農桿菌對植物細胞的附著和轉化。如果浸染時間太短，農桿菌來不及侵入細胞內部；浸染時間太長，農桿菌容易對外植體細胞造成侵害，導致外植體的存活率下降，結果見表4。

表4 不同浸染時間對發根誘導率的影響

從表4中可以看出，浸染時間在6～8min誘導效果相對較好，8min之后平均誘導率開始急劇下降，并且菌大量生長，外植體軟腐，部分死亡。

3 結論

利用發根農桿菌1025浸染牛膝的葉片為轉化材料，當感染8min，轉化率最高。在培養基中添加50μmol·L－1AS可以提高牛膝發根的轉化效率。

試驗利用4種農桿菌對牛膝外植體進行感染，誘導出了發根，但其誘導率有所不同，可能因為4種農桿菌的生長周期不同導致其誘導能力不同。發根農桿菌的誘導能力表現在發狀根數目和發狀根出現所需時間兩個方面，另外還受宿主植物的種、品種、生理狀態、環境條件、宿主范圍等因素的影響。

在用不同濃度AS對牛膝進行發狀根培養時，濃度過低除菌不徹底，造成霉菌產生，而濃度過高導致牛膝外植體中毒死亡，適宜的濃度可使牛膝發狀根生長快速。

綜合上述各因素的影響，我們得出了誘導牛膝發根的最佳條件：用牛膝葉片作為外植體，發根農桿菌1025浸染8min，培養基中添加50μmol·L－1AS。該實驗為下一步獲得大量牛膝發根和提高其多糖、三萜皂苷類物質含量的篩選工作奠定了基礎。確立牛膝發根的離體培養條件和對發根中多糖、皂苷類物質的提取是我們下一步工作亟待解決的問題。

［1］高曉山.“四大懷藥”考按［J］.河南中醫，1994，14（3）：42.

［2］國家藥典委員會.中國藥典（一部）［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：68.

［3］中國醫學科學院藥物研究所.中草藥有效成分的研究（第一分冊）［M］.北京：人民衛生出版社，1972：398.

［4］湖南醫藥工業研究所.齊墩果酸治療急性黃疸肝炎療效和實驗動物的組織學初步觀察［J］.中草藥通訊，1977，（4）：32.

［5］劉偉華，徐香玲，姜靜，等.植物基因工程中Ri質粒的研究與應用［J］.植物研究，1995，15（3）386-390.

［6］蔡國琴，李國珍，葉和春，等.Ri質粒轉化的青蒿發根培養及青蒿素的生物合成［J］.生物工程學報，1995，11（4）：315-320.

Effect of Different Conditions of Culture on Inducement of Hairy Roots ofAchyranthes BidentataBl.

Bi Bo1，Xu Dawei2，Wen Yuli3，Liu Yalei4，Yang Shihai3，Lin Yue4
（1.Academic Office，Jilin Agricultural Science and Technology College，Jilin Jilin132109，China；2.China National Corp.of Traditional＆Herbal Medicine，Beijing100195，China；3.College of Medicinal Materials，Jilin Agricultural University，Changchun Jilin130118，China；4.Education Department of basic courses，Hebei Medical University，Shijiazhuang Hebei050091，China）

Objective：To induce hairy roots ofAchyranthes bidentataBl.byAgrobacterium rhizogenesA4，R1，1601，1025.Methods：Hairy roots were induced by co-culture.Effects of different types of bacteria，different explants，different infection time and different concentrations of acetosyringone on the transformation frequency were studied.ResultsThe highest induction frequency was obtained from leaves withAgrobacterium rhizogenes1025 infection which were infected 8min.The transformation frequency could be raised by culture medium with 50μmol·L－1acetosyringone.ConclusionHairy roots were induced by co-culture and the optimum induced condition was determined to improve the induction rate of explants.

Achyranthes bidentataBl.；Agrobacterium rhizogenes；Hairy roots；Induction rate

*楊世海，E-mail：jlyangs＠163..com

2009-11-04）