DM301型大孔吸附樹脂分離純化大黃總蒽醌的研究△

曹騁，葉殷殷，王浩龍，江濱

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

DM301型大孔吸附樹脂分離純化大黃總蒽醌的研究△

曹騁*，葉殷殷，王浩龍，江濱

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

目的：研究DM301大孔樹脂對(duì)大黃總蒽醌的吸附性能及分離純化工藝參數(shù)。方法：以大黃總蒽醌含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用紫外分光光度法測(cè)定大黃總蒽醌的含量。結(jié)果：DM301大孔樹脂對(duì)大黃總蒽醌適宜的交換吸附條件為：以10g大孔吸附樹脂為標(biāo)準(zhǔn)量，最大上樣量為3.4g·g－1（生藥材／干樹脂），最佳上柱工藝為藥液濃度含生藥量0.40g·m L－1，pH6，流速為1mL·min－1，90%乙醇洗脫，洗脫液用量為80mL。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明，DM301對(duì)大黃總蒽醌的動(dòng)態(tài)吸附率在70%以上，洗脫率在80%以上。結(jié)論：DM301大孔樹脂交換吸附大黃總蒽醌的純化方法可取，具有良好的應(yīng)用前景。

DM301大孔吸樹脂；大黃；總蒽醌；分離純化

大黃為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatumL.、唐古特大黃Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃Rheum officinaleBaill.的干燥根及根莖。其味苦、性寒，具有瀉下攻積，清熱瀉火，涼血解毒，逐瘀痛經(jīng)，利濕退黃的功能［1］，為臨床常用中藥之一。大黃的化學(xué)成分較復(fù)雜，其主要成分為蒽醌類衍生物，傳統(tǒng)分離提取大黃總蒽醌有明膠沉淀法、醇沉調(diào)pH值法、聚酰胺法等。近年來，大孔吸附樹脂在中藥的提取、分離、富集方面得到廣泛運(yùn)用，不斷受到藥學(xué)研究者的關(guān)注。金波等［2］以大黃總蒽醌的提取率及洗脫率為考察指標(biāo)，考察大黃的提取條件及WLD型大孔吸附樹脂富集、純化大黃總蒽醌的吸附性能和洗脫參數(shù)。通過大孔吸附樹脂富集與純化，用70%乙醇洗脫，總蒽醌的洗脫收率在80%以上。許漢林等［3］比較了 D301、AB-8、X-5、NKA-2、H1020型號(hào)的5種大孔樹脂對(duì)大黃總蒽醌的吸附性能，該研究認(rèn)為D301樹脂對(duì)大黃總蒽醌的吸附性能較好。DM301型樹脂是一種中等極性的樹脂，對(duì)分離黃酮類、生物堿、蒽醌類等成分有較為明顯的效果，目前應(yīng)用DM301型樹脂純化大黃總蒽醌的研究卻尚未見報(bào)道。本文通過對(duì)提取液pH、提取液濃度、最大上樣量、洗脫液濃度、洗脫流速、洗脫用量等方面的考察得到DM301樹脂分離純化大黃總蒽醌技術(shù)參數(shù)，從而為大黃中蒽醌類有效物質(zhì)的提取和純化提供參考。

1 儀器與材料

Spectronic GENESYSTM2紫外分光光度計(jì)（美國(guó)）；SHIMADZU CORPORATION AEG-220萬分之一電子分析天平（日本島津）；Sartorius BP211D十萬分之一天平（瑞士）；PHB-4型pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

DM301樹脂（天津市海光化工有限公司）；1，8-二羥基蒽醌對(duì)照品（購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)0829-9702）。所用試劑為分析純（天津市富宇精細(xì)化工有限公司），所用水為雙蒸水。

大黃藥材由廣州致信中藥飲片有限公司提供，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定室黃海波副教授鑒定為四川產(chǎn)藥用大黃Rheum officinaleBaill.的干燥根莖。

2 方法

2.1 大黃提取液的制備

取過一號(hào)篩（10目）的大黃粉末適量，置具塞圓底燒瓶中，加入60%的乙醇溶液12倍量，于恒溫水浴鍋中加熱回流提取3次，每次30min，合并提取液，濾過，濾液減壓濃縮至無乙醇味，高速離心，3 000 r·min－1。取上清液，調(diào)節(jié)溶液質(zhì)量濃度至0.40g·mL－1，作為母液，母液中總蒽醌含量為0.76mg·mL－1。

2.2 大黃總蒽醌的含量測(cè)定

2.2.1 供試品溶液的制備 精密量取大黃提取液（或流出液）2mL，置具塞錐形瓶中，蒸干，加入2.5mol·L－1硫酸溶液10mL和三氯甲烷10mL，水浴加熱回流1h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液層用三氯甲烷提取至三氯甲烷層不顯黃色，合并三氯甲烷液，三氯甲烷液繼續(xù)用水洗至中性，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)?.5%Mg（Ac）2甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加0.5%Mg（Ac）2甲醇至刻度，搖勻。精密移取上述溶液1.0mL，置10mL容量瓶中，加0.5%Mg（Ac）2甲醇至刻度作為供試品溶液，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取P2O5干燥至恒重的1，8-二羥基蒽醌對(duì)照品適量，加乙醚制成每1mL含0.1mg的溶液，即得。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性范圍考察 精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0.20，0.60，1.00，2.00，3.00mL，分別置于10mL量瓶中，揮干三氯甲烷，殘?jiān)?.5%Mg（Ac）2甲醇溶液溶解，加至刻度，搖勻。以0.5%Mg（Ac）2甲醇溶液為空白對(duì)照，于520nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，得回歸方程：Y＝44.405X＋0.037 9，r＝0.999 8，線性范圍2.10～31.4μg·mL－1。

2.2.4 顏色穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.3項(xiàng)下3號(hào)試樣，分別在0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0h測(cè)定吸光度，其結(jié)果分別為0.511，0.511，0.510，0.509，0.507，0.502，0.496，表明顯色在2h內(nèi)較穩(wěn)定，2h以后吸光度逐漸變小，故最佳測(cè)定時(shí)間范圍為2h內(nèi)。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，以0.5%Mg（Ac）2甲醇溶液作為空白對(duì)照，在520nm處連續(xù)測(cè)定吸光度6次，結(jié)果RSD＝0.2%，表明方法精密度良好。

2.3 大孔樹脂預(yù)處理

DM301樹脂為中等極性樹脂，比表面≥330m2·g－1，平均孔徑為14～17nm，適用于黃酮類、多酚類的分離，為新購(gòu)干凈樹脂。預(yù)處理只需取樹脂適量，乙醇浸泡24h，抽濾至干，上柱，繼續(xù)用乙醇洗至流出液與水混勻不產(chǎn)生混濁，水洗至無醇味，即可。

2.4 大孔樹脂吸附量、吸附率的計(jì)算方法

吸附量＝（母液濃度－濾液濃度）×溶液體積／干樹脂量

吸附率 ＝（母液濃度 －濾液濃度）／母液濃度×100%

洗脫量＝洗脫液濃度×洗脫液體積／干樹脂量

洗脫率＝洗脫量／吸附量×100%

2.5 交換吸附大黃總蒽醌

2.5.1 pH值對(duì)DM130樹脂靜態(tài)交換吸附大黃提取液的影響 分別稱取吸干其表面水分的活化處理樹脂各1.5g，精密稱定，平行3份。分別置于50mL三角瓶中，各加入15mL大黃提取液，用2mol·L－1NaOH調(diào)節(jié) pH為 6，7，8，9，放置24h，不時(shí)振搖，濾過，取提取液及濾液1mL，按2.2.1項(xiàng)下要求制備供試品溶液，測(cè)定吸光度，計(jì)算吸附量和吸附率（），結(jié)果見表1。

表1 pH值對(duì)DM130樹脂靜態(tài)交換吸附大黃提取液的影響

結(jié)果顯示，pH對(duì)DM301樹脂靜態(tài)交換吸附容量，隨著pH的增加而減少，當(dāng)pH＝6時(shí)，DM301樹脂對(duì)大黃提取液中總蒽醌吸附性能最好。

2.5.2 提取液濃度對(duì)DM301樹脂交換吸附容量的影響 分別稱取DM301樹脂10g，上柱，分別加入含生藥量為 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5g·mL－1的大黃提取液15mL，調(diào)節(jié)流速為1mL·min－1，分別收集流出液，定容至100mL。按2.2.1項(xiàng)下要求制備供試品溶液，測(cè)定吸光度，計(jì)算吸附量和吸附率），結(jié)果見表2。

表2 提取液濃度對(duì)DM301樹脂交換吸附容量的影響

從表2結(jié)果可知，在大黃提取液含量較低時(shí)，DM301樹脂交換吸附總蒽醌的能力隨著提取液含量的提高而增加。當(dāng)提取液含量為0.4g·mL－1時(shí)，其交換能力最好，為 25.4mg·g－1，其吸附率為73.69%。

2.5.3 最大上樣量的確定 精密稱取DM301樹脂10g，上柱，加入含生藥量為0.4g·mL－1的大黃提取液100mL進(jìn)行交換吸附，調(diào)節(jié)流速為1mL·min－1，收集流出液，每5mL收集1次，共收集20份，編號(hào)，取1mL按2.2.1項(xiàng)下要求制備供試品溶液，測(cè)定吸光度。當(dāng)流出液體積為85mL時(shí)，流出液中總蒽醌含量與之前相比沒有明顯減少，故認(rèn)為每克干樹脂最大吸附大黃藥材量為3.4g。

2.5.4 不同乙醇含量對(duì)蒽醌類成分動(dòng)態(tài)洗脫率的影響 取DM301樹脂160g，加入含生藥量0.4g·mL－1大黃提取液2 000mL進(jìn)行交換吸附，放置24h，不時(shí)振搖，濾過，抽干水分。分別稱取已交換吸附大黃提取液的大孔樹脂各10g，上柱，平行3份。分別用水洗至洗脫液接近無色，分別用30%，45%，60%，75%，90%的乙醇各250mL進(jìn)行洗脫，按1mL·min－1的流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，揮去乙醇，定容為100mL，按2.2.1項(xiàng)下要求制備供試品溶液，測(cè)定吸光度，計(jì)算洗脫量（），結(jié)果見表3。

表3 不同乙醇含量對(duì)蒽醌類成分動(dòng)態(tài)洗脫率的影響

如表3所示，隨著乙醇含量增加，洗脫大黃總蒽醌的能力提高，故認(rèn)為90%乙醇洗脫大黃總蒽醌效果較好。

2.5.5 流速對(duì)洗脫能力的影響 取DM301樹脂160g，加入含生藥量0.4g·mL－1大黃提取液2 000mL進(jìn)行交換吸附，放置24h，不時(shí)振搖，濾過，抽干水分。平行3份，上柱。用水洗至洗脫液接近無色，用90%乙醇150mL，分別調(diào)節(jié)流速為 0.5，0.75，1，1.25，1.5 mL·min－1進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，揮去乙醇，定容為50mL，按2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定吸光度，計(jì)算洗脫量（），結(jié)果見表4。

表4 流速對(duì)洗脫能力的影響

如表4所示，當(dāng)流速為1mL·min－1時(shí)，90%乙醇對(duì)大黃總蒽醌洗脫能力最高。

2.5.6 洗脫用量的確定 取DM301樹脂10g上柱，平行3份。分別加入含生藥量0.4g·mL－1大黃提取液15mL，待吸附后，用去離子水洗脫至流出液不呈黃色，用90%乙醇洗脫，收取洗脫液，每10mL收取一次，共收集13份，揮去乙醇，定容至10mL量瓶中，按2.2.1項(xiàng)下要求制備供試品溶液，測(cè)定吸光度。當(dāng)收集到第8份時(shí)，洗脫液中總蒽醌含量已降至0.010 5mg·mL－1，故認(rèn)為用90%乙醇洗脫劑80mL能將大黃總蒽醌基本洗脫下來。

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取DM301樹脂10g，上柱，平行3份。分別加入0.4g·mL－1大黃提取液10mL進(jìn)行動(dòng)態(tài)交換吸附，水洗至洗脫液接近無色后，90%乙醇80mL，調(diào)節(jié)流速1mL·min－1進(jìn)行洗脫，收取洗脫液，揮去乙醇后，定容成25mL，按2.2.1項(xiàng)下要求制備供試品溶液，測(cè)定吸光度，計(jì)算吸附率、解吸附率、RSD，結(jié)果見表5。

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由表5結(jié)果可知，DM301樹脂分離純化大黃總蒽醌的工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

大孔吸附樹脂是一類不含離子交換基團(tuán)的交聯(lián)聚合物，由于范德華力及氫鍵的作用而具有吸附性，還因具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和很高的比表面積而具有篩選性能。因此，大孔吸附樹脂在中藥的提取、分離、富集方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。但對(duì)于不同型號(hào)的大孔吸附樹脂，其樹脂本身的極性、孔徑、比表面積、孔容以及上柱溶液的濃度、體積、pH值、化學(xué)成分的性質(zhì)等均影響其分離、富集效果。同時(shí)，其解吸還受到洗脫劑的種類、濃度、體積、程序、流速的影響。

本研究考察了DM301型大孔樹脂對(duì)大黃總蒽醌類成分吸附純化的工藝，從靜態(tài)和動(dòng)態(tài)兩個(gè)方面進(jìn)行考察，靜態(tài)交換吸附主要考察了溶液pH對(duì)吸附能力的影響；動(dòng)態(tài)交換吸附則從上樣液的濃度、最大上樣量，洗脫劑的含醇量、洗脫流速、洗脫液的用量進(jìn)行考察，從而得到最佳的純化工藝參數(shù)。

DM301樹脂是苯乙烯型中極性共聚體，具有較大的孔徑，適用于純化有一定弱極性和極性的有機(jī)化合物。蒽醌類物質(zhì)多含有酚羥基，可作為良好的氫鍵供體，有利于被極性樹脂吸附。實(shí)驗(yàn)表明DM301型樹脂對(duì)蒽醌類物質(zhì)具有較強(qiáng)的富集能力。本實(shí)驗(yàn)研究初步確定DM301樹脂對(duì)大黃總蒽醌純化條件為：以10g大孔吸附樹脂為標(biāo)準(zhǔn)量，最大上樣量為3.4g·g－1（生藥量／干樹脂），最佳上柱工藝為藥液濃度含生藥量0.4g·mL－1，pH6，流速為 20d·min－1，90%乙醇解吸效果較好，洗脫用量為80mL。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明，DM301樹脂對(duì)大黃總蒽醌的動(dòng)態(tài)吸附率在70%以上，洗脫率在80%以上，純化效果良好。DM301樹脂純化大黃總蒽醌工藝穩(wěn)定，方法可取，具有良好的應(yīng)用前景。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典（一部）［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：22-23.

［2］金波，李薇，蔡偉.大黃總蒽醌提取與純化工藝的研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2005，16（8）：756.

［3］許漢林，陳軍，張赤志.不同型號(hào)大孔樹脂對(duì)大黃總蒽醌吸附的研究［J］.湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，7（4）：20-22.

《藥用植物栽培學(xué)》

《藥用植物栽培學(xué)》由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)郭巧生教授主編，分總論、各論、附篇及配套光盤四大部分?？傉摬糠止卜?章，主要介紹藥用植物栽培學(xué)的基本理論和方法等內(nèi)容。各論部分按入藥部位分為6章，從植物學(xué)形態(tài)、生長(zhǎng)習(xí)性、繁殖方法、田間管理、病蟲害防治、留種技術(shù)、產(chǎn)地加工及貯藏和運(yùn)輸?shù)确矫嬖敱M地介紹了具有地區(qū)和用藥代表性的36種常用藥用植物規(guī)范化栽培技術(shù)。附篇補(bǔ)充收載了34種藥用植物的規(guī)范化栽培技術(shù)內(nèi)容。配套光盤除收載了全書內(nèi)容外，還收錄了國(guó)內(nèi)外有關(guān)藥用植物生產(chǎn)的法規(guī)和條例，以及大量與本書有關(guān)的彩色數(shù)碼圖片，供教學(xué)時(shí)選用。

本書主要作為農(nóng)林和中醫(yī)藥高等院校中藥、藥用植物或相近專業(yè)的教材和教學(xué)參考書，同時(shí)亦可供有關(guān)中藥材生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)和中藥資源開發(fā)利用及其他經(jīng)濟(jì)植物研究和生產(chǎn)的專業(yè)技術(shù)人員參考。

Study of the Purification of Total Anthraquinones in Rheum Officinale Baill.by DM301 Macroporous Resin

Cao Cheng，Ye Yinyin，Wang Haolong，Jiangbin
（1.Traditional Chinese Pharmaceutical College of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou Guangdong510006，China）

Objective：Study the property of adsorption and purification technology parameters of total anthraquinones inRheum officinaleBaill.by DM301 macroporous resin.Methods：Using the content of total anthraquinones inRheum officinaleBaill.as the evaluation indicator，the content of total anthraquinones inRheum officinaleBaill.was determined by Ultraviolet spectrophotometry.Results：The content of total anthraquinones inRheum officinaleBaill.was the evaluation indicator and determined by Ultraviolet spectrophotometry.Results：The optimum adsorption condition is：the maximum sample volumes is3.4g·g－1（crude drug／drymacroporous resin）with the 10gmacroporous resin.，the concentration is0.4g crude drug permilliliter，pH6，flow rate 20d·min－1，eluted by 80mL and 90%alcohol，the verification experiment show that the adsorption rate reach more than 70%，the desoption rate reach more than 80%.Conclusion：The method of using DM301 macroporous resin to purificate total anthraquinones inRheum officinaleBaill.is effective，and it can be used more widely.

DM301 macroporous resin；Rheum officinaleBaill.；Total anthraquinones；Purification

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2006BAI06A14-06）

*曹騁，E-mail：caosir＠126.com

2010-03-29）