一株產黏植物乳桿菌發酵豆乳條件優化

李程程，陳曉紅，姜 梅，董明盛*

(南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095)

一株產黏植物乳桿菌發酵豆乳條件優化

李程程，陳曉紅，姜 梅，董明盛*

(南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095)

采用分離自泡菜的植物乳桿菌發酵豆乳。通過單因素試驗和響應曲面設計確定豆乳的最優發酵條件。結果表明：制作酸豆乳的最佳工藝條件為：豆水比1:8(m/V)、4g/100mL蔗糖+3g/100mL乳糖、接種量4%、33℃發酵8h。在此條件下，發酵酸豆乳黏度最大可達3589.1mPa·s、酸度48.88oT、感官86分，菌落總數1.2×109CFU/mL。

植物乳桿菌；響應曲面法；大豆；豆乳；工藝條件

Abstract：Soybean was used as the fermentation substrate to produce fermented soybean milk byLactobacillus plantarumisolated from pickle. The optimal production conditions of fermented soybean milk were explored by single-factor experiments and response surface methodology. Soybean-to-water ratio of 1:8 (m/V), sucrose amount of 4 g/100mL and lactose amount of 3 g/100mL, inoculum amount of 4%, incubation time of 8 h and incubation temperature of 33 ℃ were found optimum, and under these optimum conditions, the maximum viscosity of fermented soybean milk was 3589.1 mPa·s, the acidity 48.88oT, the sensory evaluation score 86, and the total bacterial count 1.2 × 109CFU/mL.

Key words：Lactobacillus plantarum；response surface methodology；soybean；soybean milk；process condition

酸豆乳是一種以大豆為原料，經乳酸菌發酵制成的一種外觀頗似酸奶的具有獨特豆香味的時尚健康食品。對豆乳進行發酵不僅為保存豆漿提供了一種方法而且有可能調整或改善其風味與質構，從而使之更適合西方人的口味[1]。乳酸細菌以及雙歧桿菌培養物發酵豆乳，對人類有相當大的益處[2-3]，酸豆乳含有豐富的植物蛋白、不飽和脂肪酸、人體必需的18種氨基酸和提高人體免疫機能的大豆低聚糖和大豆異黃酮等功能成分[4]，且不含膽固醇和乳糖，是高血壓及乳糖不耐癥患者的良好選擇。乳酸菌的作用眾所周知，另外，大豆相對于牛乳原料在中國更易獲得，大大降低了生產成本。有學者研究證明乳酸桿菌廣泛的被用作益生菌，大豆是這些益生菌生長的良好基質，干酪乳桿菌[5-6]、瑞士乳桿菌[3,7]、發酵乳桿菌[8]、嗜酸乳桿菌[9]、鼠李糖乳桿菌[10]都已經被證明能在豆乳中良好生長。

國內外對酸豆乳的研究已經很多，但植物乳桿菌作為發酵劑的研究甚少，經過拉絲實驗已經證明該植物乳桿菌是一種能夠產黏的乳酸菌，經過苯酚-硫酸法測定后發現該黏性物質是多糖，利用能夠產生多糖的乳酸菌發酵豆乳，可以增加酸豆乳的黏度以及穩定性，從而降低穩定劑的添加量，同時，作為乳酸菌的一種次級代謝產物，多糖具有一定的降血脂、降血壓、抗氧化、抑菌、抗癌等重要功能，極大的提高了酸豆乳的益生特性，對人體更加有益。

考慮到大豆中含有豐富的植物蛋白，且該菌種來源于傳統的泡菜食品，同為植物原料，發酵性能會有所提高，使菌種能夠更好的適應生長環境。本研究將以本實驗室分離的一株產黏植物乳桿菌為發酵劑，發酵豆乳生產高黏度酸豆乳，通過單因素試驗和響應曲面設計確定酸豆乳生產的最優發酵條件。以期為以后的工業化生產提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

小黃豆、蔗糖、乳糖 市售。

1.2 菌種與培養基

植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)由本實驗室分離。

MRS培養基[11]：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、葡萄糖20.0g、K2HPO42.0g、乙酸鈉5.0g、檸檬酸三銨2.0g、MgSO4·7H2O 0.58g、MnSO4·4H2O 0.25g、吐溫-801.0mL、蒸餾水1000mL，pH6.2～6.4，121℃滅菌20min。

1.3 工藝流程

原料→精選大豆→浸泡過夜(可隨季節調節時間)→磨漿→過濾→加配料→均質→分裝→滅菌→冷卻接種→發酵→成品

1.4 方法

1.4.1 發酵用菌種的處理

植物乳桿菌按體積分數2%的接種量接種于MRS培養基中，經過兩次活化后于5000r/min離心15min，取菌體懸浮于0.85g/100mL的生理鹽水中備用。

1.4.2 豆水比對發酵豆乳的影響

挑選籽粒飽滿無霉變的大豆，用清水浸泡過夜，選取1:6、1:8、1:10(m/V)的豆水比進行實驗，121℃滅菌15min，待豆乳冷卻至30℃時按4%接種量接種乳酸菌，放入30℃培養箱恒溫發酵10h，測定酸度、固形物含量。

1.4.3 碳源種類對發酵豆乳的影響

在滅好菌的豆乳中分別加入質量濃度4g/100mL的蔗糖、乳糖、D-半乳糖、D-麥芽糖、葡萄糖、果糖，按4%接種量接入菌種，于30℃發酵10h，測定其酸度。

1.4.4 碳源添加量對豆乳發酵的影響

1.4.4.1 乳糖添加量的選擇

取20mL豆乳(豆水比1:8)，分別添加0、1、2、3、4、5、6g/100mL乳糖，滅菌后冷卻到30℃左右，按4%的接種量接種，30℃恒溫發酵10h，測定其酸度。

1.4.4.2 蔗糖添加量的選擇

取20mL豆乳(豆水比1:8)，分別添加0、1、2、3、4、5、6g/100mL蔗糖，滅菌后冷卻到30℃左右，按4%的接種量接種，30℃恒溫發酵10h，測定其酸度。

1.4.5 接種量對發酵豆乳的影響

取20mL豆乳(豆水比1:8)，添加一定量的蔗糖和乳糖，分裝滅菌后冷卻到30℃左右，分別按體積分數0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%的接種量接種，30℃恒溫發酵10h，測定其酸度。

1.4.6 發酵溫度對發酵豆乳的影響

取20mL豆乳(豆水比1:8)，添加一定量的蔗糖和乳糖，滅菌后冷卻到30℃左右，按4%的接種量接種，分別于27、30、33、36、39、42、45℃條件下發酵10 h，測定其酸度。

1.4.7 發酵時間對發酵豆乳的影響

取20mL豆乳(豆水比1:8)，添加一定量的蔗糖和乳糖，分裝滅菌后冷卻到30℃左右，按4%的接種量接種，于33℃條件下分別發酵0、2、4、6、8、10、12h，發酵結束后測定其酸度。

1.5 指標測定

酸度：采用滴定酸度法[12]；總固形物含量：采用干燥法[12]；黏度：采用NDJ-8S黏度計；菌落總數：采用GB/T 4789.35—2010《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》[13]。

感官評價(總分100分)：評價標準見表1。

表1 感官評價標準Table 1 Standards of sensory evaluation for fermented soybean milk

1.6 響應曲面法優化酸豆乳發酵條件的設計

在單因素試驗結果的基礎上，以酸豆乳的酸度、黏度、感官為指標，主要影響因素為碳源添加量(A)、接種量(B)、發酵時間(C)、發酵溫度(D)，采用4因素3水平的Box-Behnken設計方法[14]，每組試驗重復3次。

表2 響應曲面試驗因素水平表Table 2 Factors and levels in the response surface design

1.7 數據處理

采用Design Expert 7.0軟件處理，并進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 豆水比的確定

表3 豆水比對發酵豆乳的影響Table 3 Effects of soybean-to-water ratio on some physico-chemical parameters and sensory evaluation of fermented soybean milk

由表3可見，隨著水量的不斷增加，豆漿的固形物含量逐漸降低。從狀態來看，豆水比為1:6和1:8時酸豆乳凝乳較好，沒有乳清析出；其他處理則有不同程度的乳清析出，且很軟。從酸度來看，豆水比為1:6、1:8及1:10時酸豆乳酸度都相近。所以，從經濟、組織狀態以及酸度方面綜合考慮，豆水比定為1:8。

2.2 碳源的確定

碳源決定益生菌的產酸量，大豆中的碳水化合物含量只有15%左右，而且還有一些種類的碳源不能被益生菌所利用。經過浸泡、分離等處理工序后，豆漿中可供益生菌利用的碳源損失較多，所以需要添加必要量的碳源以促進益生菌產酸、凝乳[15]。

2.2.1 不同種類的碳源對酸豆乳品質的影響

圖1 不同碳源對酸豆乳酸度的影響Fig.1 Effect of carbon source type on the acidity of fermented soybean milk

由圖1可見，蔗糖、乳糖、葡萄糖為碳源時酸豆乳凝乳均很好，果糖、D-麥芽糖、D-半乳糖為碳源時，凝乳較軟，其中添加蔗糖的酸豆乳滋味酸甜適口，其他糖酸甜味較淡，且果糖的有酸澀味。添加乳糖產酸量最高。故確定蔗糖和乳糖為添加碳源。

2.2.2 乳糖和蔗糖添加量對發酵豆乳的影響

圖2 不同蔗糖和乳糖添加量對酸豆乳酸度的影響Fig.2 Effect of amounts of added sucrose and lactose as carbon sources on the acidity of fermented soybean milk

由圖2可知，當乳糖添加量為3g/100mL時，酸豆乳酸度最高為49°T。添加蔗糖4g/100mL時酸度達到最大為50°T。當蔗糖添加量4g/100mL和乳糖添加量3g/100mL時，酸豆乳口感最佳，無乳清析出，且較黏稠。故選擇乳糖添加量為3g/100mL，蔗糖添加量為4g/100mL。

2.3 接種量對發酵豆乳的影響

圖3 不同接種量對酸豆乳酸度的影響Fig.3 Effect of inoculum amount on the acidity of fermented soybean milk

酸度是衡量乳酸菌發酵優良的一個重要指標，酸度高說明乳酸菌能很好的利用糖類產酸，酸度低說明乳酸菌沒有很好的生長。由圖3可知，隨著接種量的增加，酸度呈上升趨勢，到4%時達到最高，隨后有所降低，這是因為乳酸菌發酵要利用糖類等一些物質，接種量低時，菌種不能完全利用糖類，接種量太高，糖類又不足，因此，只有接種量適宜時，才能使糖類的利用發揮最大的效用。故選擇接種量為4%。

2.4 發酵溫度對發酵豆乳的影響

圖4 不同發酵溫度對酸豆乳酸度的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the acidity of fermented soybean milk

由圖4可以看出，27～39℃范圍內隨著發酵溫度的升高，酸度逐漸升高，之后酸度開始降低，33℃和36℃時酸度基本相同，39℃時酸度達到最高，但33℃時感官較好，且優考慮到植物乳桿菌的最適生長溫度是30～35℃，所以確定33℃為最佳發酵溫度。

2.5 發酵時間對發酵豆乳的影響

圖5 不同發酵時間對酸豆乳酸度的影響Fig.5 Effect of fermentation time on the acidity of fermented soybean milk

發酵時間的長短對于酸豆乳的工廠化生產有很大的影響，時間越短，可以更有效的節省資源。由圖5可見，隨著發酵時間的延長，酸度逐漸升高，8h和12h時酸度都較高，故確定8h為最佳發酵時間。

2.6 響應曲面試驗設計及結果

在單因素試驗結果基礎上，確定豆水比為1:8，乳糖添加量為3g/100mL的條件下，進行響應面試驗設計，結果見表4。

表4 響應曲面試驗設計與結果Table 4 Response surface central composite design matrix and experimental results

2.6.1 回歸模型的建立

用Design Expert 7.0軟件對表8中的數據進行分析，得出4個影響因素與黏度、酸度、感官3個響應值之間的二次回歸方程：

黏度模型的P＜0.0001，說明方差模型達到顯著，失擬項P=0.0086＜0.05，說明模型擬合顯著，模型的總決定系數R2達0.9472，表明響應值的變化有94.72%來自所選因素；AB對黏度的交互作用顯著。

酸度模型的P=0.0153＜0.05，說明方差模型達到顯著，失擬項P=0.183＞0.05，說明模型擬合不顯著，模型的擬合程度很好。模型的總決定系數R2達0.7704，表明響應值的變化有77.04%來自所選因素；BC對酸度的交互作用顯著。

感官模型的P=0.006＜0.05，說明方差模型達到顯著，失擬項P=0.0838＞0.05，說明模型擬合不顯著，模型的擬合程度很好。模型的總決定系數R2達0.8673，表明響應值的變化有86.73%來自所選因素；BD對感官的交互作用顯著。

2.6.2 響應面分析

圖6 碳源和接種量交互影響黏度的響應曲面Fig.6 Response surface plot illustrating the interactive effects of inoculum amount and carbon source amount on the viscosity of fermented soybean milk

圖7 發酵時間和接種量交互影響酸度的響應曲面Fig.7 Response surface plot illustrating the interactive effects of fermentation time and inoculum amount on the acidity of fermented soybean milk

由圖6可以看出，隨著接種量和碳源的增加，黏度先增高后下降，其中碳源下降的較快；由等高線圖可以看出，碳源相對于接種量等高線陡峭說明碳源對黏度的影響較接種量更顯著。由圖7可以看出，當接種量在3%～4%范圍時酸度隨接種量的增加先升高后降低，當接種量在4%～5%時酸度隨接種量的增加逐漸降低。由等高線圖可以看出發酵時間相對于接種量等高線陡峭，說明發酵時間對酸度的影響更顯著。由圖8可以看出，隨著接種量和發酵溫度的增加，感官分值先增高后下降，由等高線可以看出碳源相對于接種量等高線較陡峭說明碳源對感官影響更顯著。

圖8 發酵溫度和接種量交互影響感官評價值的響應曲面Fig.8 Response surface plot illustrating the interactive effects of fermentation temperature and inoculum amount on the sensory score of fermented soybean milk

2.6.3 配方的優化組合及驗證

根據Box-Behnken試驗所得結果和二次多項式方程，利用Design-Expert軟件計算出最佳條件選擇：蔗糖添加量4.39g/100mL、接種量3.89%、發酵時間8.08h、發酵溫度32.83℃，為了便于操作將上述條件參數修訂為蔗糖4g/100mL、接種量4%、發酵時間8h、發酵溫度33℃，在此最佳條件下，酸豆乳黏度3021.5mPa·s、酸度47.13oT、感官得分86分，菌落總數1.2×109CFU/mL。根據軟件給出的最優條件進行驗證實驗，黏度為3589.1mPa·s，酸度為48.88oT，感官得分為86，菌落總數1.2×109CFU/mL，與軟件給出的結果較為吻合，可見該實驗設計方法可靠高效。

3 結論與討論

大豆在國內占有大量的比例，易于獲得，價格相對于牛乳較低，如果能夠采用發酵法生產一種類似于酸乳的乳酸菌發酵豆乳產品，將會給人們生活帶來極大好處。關于乳酸菌發酵生產酸豆乳，前人也已經做過很多研究。至于發酵豆乳用的乳酸菌，發現泡菜里面有些乳酸菌能夠有效利用植物中的成分使之產酸，在國內泡菜資源也很豐富，而且微生物結構比較復雜，廣泛存在著優良的乳酸菌，可以作為分離篩選優良菌種的來源，泡菜中主要存在著植物乳桿菌、短乳桿菌、腸膜明串珠菌、戊糖片球菌。

植物乳桿菌廣泛存在于泡菜中，是一種安全無公害的有益菌種?？紤]到大豆和泡菜原料均為植物性原料，因此有一定的發酵相似性。植物乳桿菌在發酵豆乳上具有其他均無法比擬的優越性，它既可以高效率的利用乳糖轉化為乳酸，又可以利用乳清中的殘余蛋白質[16]。

通過單因素試驗和響應曲面試驗，最后確定利用植物乳桿菌發酵不添加任何輔料的大豆乳的最佳工藝配方是：乳糖加量3g/100mL、蔗糖添加量4g/100mL、接種量4%、發酵時間8h、發酵溫度33℃。采用該菌種發酵豆乳具有一定的優越性，無論是在產酸、產黏，還是菌落總數上都好于其他菌株。

賀曉光等[17]采用從市售酸奶和自制泡菜中分離的乳酸菌進行豆乳發酵，在36℃條件下發酵需要24h才可以發酵完全，而本實驗中只需33℃發酵8h即可。大大縮短了發酵時間，有利于生產工藝的進行。劉希山等[18]采用嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌混合培養發酵豆乳，其黏度最高可達到2200mPa·s，本實驗采用植物乳桿菌發酵，酸豆乳黏度可達3589.1mPa·s。Kamaly[19]采用雙歧桿菌發酵豆乳，發酵結束后酸豆乳的菌落總數在107～108個數量級，與本實驗酸豆乳中的菌落總數為108～109個數量級基本一致，并且雙歧桿菌發酵時要求嚴格厭氧，操作要求嚴格不利于大規模的工業化生產，而植物乳桿菌是兼性厭氧菌，有利于工業化生產。

通過本實驗研究，證明植物乳桿菌在發酵豆乳上確實具有良好的特性，尤其是在產黏上遠好于其他菌株。前人的研究結果均表明利用植物乳桿菌生產出一種高黏度發酵豆乳是切實可行的。

[1] 劉克順. 大豆化學加工工藝與應用[M]. 哈爾濱:黑龍江科學技術出版社, 2005:140-145.

[2] FARNWORTH E R, MAINVILLE I, DESJARDINS M P, et al. Growth of probiotic bacteria and bifidobacteria in a soy yogurt formulation[J].International Journal of Food Microbiology, 2007, 116(1):174-181.

[3] WANG Y C, YU R C, YANG H Y, et al. Sugar and acid contents in soymilk fermented with lactic acid bacteria alone or simultaneously with bifidobacteria[J]. Food Microbiology, 2003, 20(3):333-338.

[4] 郭順堂, 徐婧婷. 大豆食品品質、功能性成分研究進展[J]. 農產品加工:創新版, 2009(7):39-43.

[5] MURTI T W, LAMBERET G, BOUILLANNE C, et al. Croissance des lactobacilles dans I’ extrait de soja. Effets sur la viscosité, les composés volatils et la protéolyse[J]. Science des Aliments, 1993, 13(3):491-500.

[6] GARRO M S, de VALDEZ G F, OLIVER G, et al. Starter culture activity in refrigerated fermented soymilk[J]. Journal of Food Protection,1999, 62:808-810.

[7] ANGELES A G, MARTH E H. Growth and activity of lactic-acid bacteria in soymilk[J]. Journal of Milk and Food Technology, 1971, 34:30-36.

[8] GARRO M S, de VALDEZ G F, de GIORI G S. Application of conductimetry for evaluation of lactic starter culture in soymilk[J]. Journal of Food Science, 2001, 67(3):1175-1178.

[9] MITAL B K, STEINKRAUS K H, NAYLOR H B. Growth of lactic acid bacteria in soy milks[J]. Journal of Food Science, 1974, 39(5):1018-1022.

[10] FARNWORTH E R, MAINVILLE I, DESJARDINS M P, et al. Growth of probiotic bacteria and bifidobacteria in a soy yogurt formulation[J].International Journal of Food Microbiology, 2006, 116(1):174-181.

[11] 呂兵, 張國農. 分離自傳統臘腸中的乳酸菌的特性研究[J]. 食品與發酵工業, 2004, 30(8):64-65.

[12] GB/T 5009146—2003 植物性食品中有機氯和擬除蟲菊酯類[S].

[13] GB/T 4789.35—2010 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗[S].

[14] 蓋鈞鎰. 試驗統計方法[M]. 北京:中國農業出版社, 2003:20-25.

[15] 徐成勇. 益生菌豆酸乳發酵條件的優化[J]. 食品與發酵工業, 2008,34(9):156-162.

[16] 曲冬梅, 劉小杰. 植物乳桿菌及其在食品工業中的應用[J]. 中國食品添加劑, 2008(增刊1):219-222.

[17] 賀曉光, 方海田, 劉慧燕, 等. 大豆發酵生產酸豆乳的工藝研究[J].現代食品科技, 2008, 24(12):1268-1270.

[18] 劉希山, 羅欣, 梁榮蓉, 等. 嗜酸乳桿菌與嗜熱鏈球菌混合培養制作保健型發酵乳的研究[J]. 中國食物與營養, 2005(10):34-37.

[19] KAMALY K M. Bifidobacteria fermentation of soybean milk[J]. Food Reseach International, 1997, 30(9):675-682.

Optimization of Fermentation Conditions for Viscosity-producingLactobacillus plantarumto Prepare Soybean Milk

LI Cheng-cheng，CHEN Xiao-hong，JIANG Mei，DONG Ming-sheng*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

TS201.3

A

1002-6630(2010)17-0201-05

2010-04-19

國家“863”計劃項目(2007AA10Z354)；江蘇省農業科技自主創新項目(CX(08)113)

李程程(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為食品微生物與生物技術。E-mail：lichengcheng1162@sina.com

*通信作者：董明盛(1961—)，男，教授，博士，研究方向為食品微生物與生物技術。E-mail：dongms@njau.edu.cn