常靜瑤,龐廣昌*,李 楊
(天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津 300134)
螺旋藻多糖通過腹腔黏膜對(duì)小鼠產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)作用
常靜瑤,龐廣昌*,李 楊
(天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津 300134)
目的:分析螺旋藻多糖3種不同給藥途徑對(duì)小鼠血清中24種細(xì)胞因子的影響,進(jìn)而研究螺旋藻多糖對(duì)小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。方法:通過灌胃、腹腔注射、尾靜脈注射3種途徑分別給小鼠不同劑量的螺旋藻多糖,對(duì)照組給與實(shí)驗(yàn)組同等體積的生理鹽水。灌胃組在3h后眼球取血,腹腔注射和尾靜脈注射組在2h后眼球取血,分離血清,采用Millipore小鼠細(xì)胞因子試劑盒和液體芯片掃描儀檢測血清中24種細(xì)胞因子的濃度。結(jié)果:3種給藥方式小鼠的IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ等炎癥細(xì)胞因子都有不同程度的顯著性升高,說明螺旋藻多糖對(duì)炎癥細(xì)胞因子的分泌和先天免疫有促進(jìn)作用。其中,腹腔注射螺旋藻多糖對(duì)細(xì)胞因子的影響最為顯著,這種方式的信號(hào)傳導(dǎo)途徑主要包括NF-κB、MAPK、JAK/STAT等。結(jié)論:從螺旋藻多糖對(duì)小鼠細(xì)胞因子的影響來看,總體上表現(xiàn)出促進(jìn)免疫的作用,推測螺旋藻多糖主要是通過對(duì)腸黏膜系統(tǒng)的受體相互作用,刺激相應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子來發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用和多種生理功能的。
螺旋藻多糖;細(xì)胞因子;免疫調(diào)節(jié)作用
Abstract:Objective:To analyze the effects of three different administration routes ofSpirulina platensispolysaccharides on 24 cytokines in mouse serum, followed by understanding of the immunoregulatory effect ofSpirulina platensispolysaccharides.Methods:Three administration routes used were oral administration, intraperitoneal injection and intravenous injection at different doses each. Mice orally administered the same volume of normal saline were served as a control group. Serum was separated from eye ball at 3 h after administration for oral administration and at 2 h after administration for intraperitoneal injection and intravenous injection. The contents of 24 cytokines in mouse serum were examined using Milliplex map kit or luminex xMAP technology. Results:Compared with the control group, each treatment group showed significantly higher serum IL-1α, IL-1β, IL-6, TNF-α and IFN-γ contents, indicating thatSpirulina platensispolysaccharides have an anxo-action on inflammation cytokines. Among the three administration routes, the effect of intraperitoneal injection on cytokines was the most obvious, and the cell signaling mode of this route mainly consisted of NF-κB,MAPK and JAK/STAT. Conclusion:In general,Spirulina platensispolysaccharides have immunopromoting effect on cytokines, and their immunoregulatory and multiple physiological functions may be exerted through interactions among intestinal mucous membrane receptors and exciting the secretion of cytokines by homologous cells.
Key words:Spirulina platensispolysaccharides;cytokine;immunoregulatory effect
螺旋藻多糖(polysaceharide fromSpirulina platensis,PSP)是從螺旋藻中提取的一種酸性、水溶性的雜多糖,除了具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值外,還具有多種生物活性和免疫調(diào)節(jié)功能,如抗輻射、抑制腫瘤、抗凝血、抗病毒感染以及降低血糖等,已經(jīng)成為國內(nèi)外藥物研究開發(fā)的熱點(diǎn)之一[1-3]。
早在1988年中國科學(xué)院海洋研究所就發(fā)現(xiàn)螺旋藻多糖可以提高核酸內(nèi)切酶活性、促進(jìn)DNA的修復(fù)合成,并對(duì)體內(nèi)移植性癌細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用[4],這一發(fā)現(xiàn)引起國內(nèi)生物醫(yī)學(xué)界對(duì)螺旋藻多糖應(yīng)用于防輻射和抗癌功能的普遍關(guān)注和廣泛研究。為探明其機(jī)理,他們通過免疫功能的實(shí)驗(yàn)證明螺旋藻多糖可以提高巨噬細(xì)胞的吞噬活性,提高小鼠外周血中T淋巴細(xì)胞和血清溶血素的含量,因此螺旋藻多糖不但能提高機(jī)體非特異性的細(xì)胞免疫,而且能促進(jìn)機(jī)體特異性的體液免疫。而這一系列免疫功能的提高,又與螺旋藻多糖有增強(qiáng)骨髓細(xì)胞增殖活力,促進(jìn)胸腺、脾臟等免疫器官生長和促進(jìn)血清蛋白生物合成的功能有關(guān)[5]。螺旋藻多糖作為一種免疫增強(qiáng)劑,一方面能增強(qiáng)骨髓細(xì)胞的增殖活力,有利于巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的形成和活性的激活;另一方面還能促進(jìn)IL-2的分泌,通過促進(jìn)血清蛋白的生物合成調(diào)節(jié)機(jī)體抗體的形成。有實(shí)驗(yàn)表明,用螺旋藻多糖灌胃或腹腔注射,可以提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù),提高外周血中T淋巴細(xì)胞和血清溶血素的含量,并且提高小鼠自然殺傷細(xì)胞的活力,促進(jìn)白細(xì)胞介素的產(chǎn)生,增強(qiáng)小鼠的免疫機(jī)能[6]。螺旋藻多糖還能促進(jìn)脾、胸腺等免疫器官的生長,減輕或消除免疫抑制劑對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的抑制作用。
本實(shí)驗(yàn)從螺旋藻粉中提取出螺旋藻多糖,以小鼠為研究對(duì)象,通過3種不同給藥途徑測定小鼠血清中24種細(xì)胞因子濃度的變化,并使用統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)細(xì)胞因子的變化情況進(jìn)行分析,進(jìn)而研究螺旋藻多糖對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。
螺旋藻粉 內(nèi)蒙古鄂托克旗烏蘭鎮(zhèn);小鼠細(xì)胞因子試劑盒 Millipore公司。
Balb/c小鼠,雄性,清潔級(jí),8~9周齡,20~25g/只,購自天津市利居生物用品供應(yīng)中心。
RE-52A旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;722型紫外-可見光分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;3K15高速冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司;液體芯片掃描儀 Millipore公司。
稱取100g螺旋藻干粉,按固液比1:10(m/V)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的焦磷酸鈉破壁,按固液比1:9,80℃抽提6h,經(jīng)4000r/min離心取上清,留上清液,將殘?jiān)M(jìn)行第二次抽提,將兩次離心所得上清液合并,放入冰箱備用。取上清液,減壓濃縮至原體積的1/5,加入3~5倍體積的95%乙醇沉淀,4℃冰箱中放置12h取出,于4000r/min離心20min,收集沉淀,用蒸餾水將沉淀充分溶解,按固液比1:8制成溶液,調(diào)pH值為7.0,加入中性蛋白酶,在50℃保溫2.5h,待完全酶解后,采用Sevag法(Sevag法脫蛋白:將沉淀溶于一定量的水中,加一定量的體積比為3:1的氯仿異戊醇的混合液,振蕩一段時(shí)間,4000r/min離心除去沉淀,重復(fù)此過程,直至無絮凝物出現(xiàn))進(jìn)行除蛋白處理7次,去除氯仿層,得水相層。除蛋白后的粗多糖液中加入4倍體積的95%乙醇,使螺旋藻多糖呈絮狀沉淀析出,靜置過夜,取出于4000r/min離心20min,收集沉淀,再用乙醇、丙酮、乙醚抽洗多次,最后冷凍干燥成干粉,即螺旋藻粗多糖,可以長時(shí)間保存?zhèn)溆肹7]。
配制0.5mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和2mg/mL的硫酸-蒽酮溶液,并精密吸取溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL置于50mL容量瓶中,加蒸餾水至刻度,搖勻。吸取上述各溶液2mL,另取蒸餾水2mL作為空白對(duì)照,置有塞的試管中,加硫酸-蒽酮溶液5mL搖勻,于沸水浴中加熱15min,冷卻,于620nm波長處測定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出方程。
準(zhǔn)確稱取105℃干燥至質(zhì)量恒定的螺旋藻多糖50mg,在燒杯中溶解,轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中,加蒸餾水定容至刻度,搖勻。吸取該溶液2mL,置有塞的試管中,按標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟操作,以蒸餾水為空白對(duì)照,測定吸光度(A),由回歸直線方程及其相關(guān)系數(shù)求得質(zhì)量濃度(C),按式(1)、(2)求多糖純度、多糖提取率。
式中:C為稀釋后硫酸蒽酮法所測吸光度經(jīng)由回歸直線方程求得的多糖質(zhì)量濃度/(μg/mL);N為稀釋倍數(shù);m為藻粉質(zhì)量/g;m1為粗多糖取樣質(zhì)量/g;m2為藻粉提取所得多糖質(zhì)量/g;V為樣品溶液總體積/mL。
Balb/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,隨機(jī)分成4組,每組3只:空白對(duì)照組、口服灌胃組、腹腔注射組、靜脈注射組。口服灌胃組螺旋藻多糖的給藥劑量為1000mg/kg,腹腔注射組給藥劑量為400mg/kg,靜脈注射組給藥劑量為200mg/kg,對(duì)照組給與實(shí)驗(yàn)組同等劑量的生理鹽水。在實(shí)驗(yàn)前一天晚上禁食,口服灌胃組在給藥后3h摘除眼球取血,注射組在給藥后2h摘除眼球取血,4℃離心分離血清(3500r/min,離心15min),分裝,-20℃保存待測。
選用Millipore小鼠細(xì)胞因子試劑盒,利用最新開發(fā)的Liquichip workstation液相蛋白芯片系統(tǒng),采用xMAP技術(shù)(flexible muti-analyte profiling),來檢測各種細(xì)胞因子的濃度,具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。
應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)用±s表示,采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn),所有表格應(yīng)用Excel軟件繪制。
以葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=0.0114C+0.001,最佳測量質(zhì)量濃度為:10~60μg/mL。采用硫酸蒽酮法測定螺旋藻中多糖的提取率和純度,計(jì)算出實(shí)驗(yàn)結(jié)果:100g螺旋藻中提取的多糖為1.576g,多糖純度為75%。
本實(shí)驗(yàn)檢測的24種細(xì)胞因子中包括:白細(xì)胞介素類:IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-17;干擾素類:IFN-γ;腫瘤壞死因子類:TNF-α;集落刺激因子類:G-C S F、G M-C S F;趨化因子類:Eotaxin、KC、MCP-1、IP-10、MIP-1α、RANTES、VEGF。
在灌胃組中,螺旋藻多糖口服后上調(diào)了Eotaxin、IFN-γ、IL-1 α、IL-1 β、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12(p70)、IL-17、VEGF、TNF-α、G-CSF、KC的表達(dá)量,即給藥組被檢血清中的濃度高于對(duì)照組的濃度;IL-9、IL-13、IL-12(p40)、IL-10給藥組血清中細(xì)胞因子的濃度都低于對(duì)照組血清中細(xì)胞因子的濃度;而GM-CSF、IL-2、IP-10、RANTES、MCP-1、MIP-1α在給藥前后血清中細(xì)胞因子的濃度沒有明顯變化,在腹腔注射組中,24種細(xì)胞因子中只有3種細(xì)胞因子,即IL-9、VEGF、G-CSF在給藥后血清中的濃度低于對(duì)照組中的濃度,其余細(xì)胞因子在給藥后血清中的濃度都高于對(duì)照組血清中細(xì)胞因子的濃度。
在靜脈注射組中,靜脈注射螺旋藻多糖后,上調(diào)了Eotaxin、IFN-γ、IL-1 β、IL-2、IL-5、IL-6、IL-10、IP-10、RANTES、VEGF、KC、MCP-1、MIP-1α、TNF-α、G-CSF的表達(dá)量,即給藥組被檢血清中的濃度高于對(duì)照組的濃度;IL-3、IL-4、IL-9、IL-13、IL-12(p70)、IL-17在給藥后血清中細(xì)胞因子的濃度低于對(duì)照組中細(xì)胞因子的濃度,而GM-CSF、IL-1α、IL-12(p40)在給藥前后血清中細(xì)胞因子的濃度沒有變化。各種細(xì)胞因子的在給藥前后的變化總結(jié)見表1。
表1 各種細(xì)胞因子在給藥前后的變化情況Table 1 Effects ofSpirulina platensispolysaccharides administered by different routes on cytokine levels in mouse serum
在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,對(duì)細(xì)胞因子總體變化量做了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn),根據(jù)P值進(jìn)行顯著性分析,結(jié)果見表2。
從表2可以看出,在灌胃組中,IL-1α、IL-6實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組血清中的濃度相比有極顯著差異(P<0.01),IL-1β、IL-17、TNF-α、VEGF濃度值有顯著差異(P<0.05);在腹腔注射組中,G-CSF、IL-10、IL-12(p40)、IP-10、KC、TNF-α實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組血清中的濃度相比均有極顯著差異(P<0.01),IFN-γ、IL-6、IL-9、MCP-1、MIP-1α、RANTES濃度值有顯著差異(P<0.05);在靜脈注射組中,G-CSF的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組血清中的濃度相比具有極顯著差異(P<0.01),IL-3、IL-9、IL-12(p70)、IL-17、IP-10、MCP-1濃度值具有顯著差異(P<0.05)。
表2 統(tǒng)計(jì)學(xué)T檢驗(yàn)變化顯著的細(xì)胞因子Table 2 Statistically significant changes of serum cytokine levels in mice administeredSpirulina platensispolysaccharides by different routes in comparison with the control group
本實(shí)驗(yàn)研究的3種給藥方式,即口服灌胃、腹腔注射和靜脈注射,不同給藥方式螺旋藻多糖對(duì)細(xì)胞因子的作用強(qiáng)度有所不同。其中,口服灌胃的給藥方式對(duì)細(xì)胞因子的影響較弱,其主要原因可能是劑量低,情況復(fù)雜,特別是經(jīng)過胃酸處理和腸道微生物的作用,其含量和免疫刺激作用已經(jīng)下降了很多[8];腹腔注射組的給藥方式對(duì)細(xì)胞因子的影響較強(qiáng),充分說明了黏膜系統(tǒng)在免疫調(diào)節(jié)中的重要作用;而靜脈注射組的給藥方式是避開腸胃道及黏膜系統(tǒng)直接進(jìn)入血液作用于小鼠的,這種方式對(duì)細(xì)胞因子的影響居于兩者之間。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果支持有關(guān)“腸黏膜系統(tǒng)是食品調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的最主要的系統(tǒng)[9]”的理論。
細(xì)胞因子(cytokine)是一類由活化的免疫細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞)和相關(guān)細(xì)胞(纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞)等產(chǎn)生的具有調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的高活性、多功能蛋白質(zhì)多肽分子或糖蛋白,主要作為細(xì)胞間信號(hào)傳遞分子,介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)等。在天然免疫應(yīng)答及獲得性免疫應(yīng)答過程中,細(xì)胞因子表現(xiàn)出重要的調(diào)節(jié)功能。近年來為研究方便,從引起機(jī)體炎癥角度來把細(xì)胞因子分為兩大類:促進(jìn)炎癥的細(xì)胞因子和抗炎癥的細(xì)胞因子。只有當(dāng)炎癥細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子達(dá)到相對(duì)平衡,才能維持機(jī)體正常的免疫狀態(tài)、抗病和正常生理活動(dòng)[10]。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,螺旋藻多糖對(duì)細(xì)胞因子是有調(diào)節(jié)作用的,總體表現(xiàn)出來的是促進(jìn)免疫的作用。3種給藥方式小鼠的 IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ等炎癥細(xì)胞因子都有不同程度的升高,說明螺旋藻多糖會(huì)刺激免疫細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子。抗炎細(xì)胞因子IL-10腹腔注射和靜脈注射兩種給藥方式濃度升高,在灌胃方式給藥后濃度降低,這可能是由于螺旋藻多糖受胃中強(qiáng)酸環(huán)境和腸道堿性環(huán)境的影響,功能成分發(fā)生變化或者在腸道中被細(xì)菌利用造成的。抗炎細(xì)胞因子IL-13在灌胃和靜脈注射兩種方式給藥后濃度都降低,但是由于IL-13是由活化的T細(xì)胞分泌的,而小腸的固有層和上皮細(xì)胞就形成最大的單一的T細(xì)胞聚集單位,所以腹腔注射方式的IL-13升高[11]。
螺旋藻多糖可能正是通過這些細(xì)胞因子作為信號(hào)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的,本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果支持有關(guān)“食品是通過細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)人類健康的”的理論[9]。
本研究表明,在灌胃組中,IL-1α、IL-6實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組血清中的濃度相比有極顯著差異,說明灌胃方式的作用途徑可能是通過JAK/STAT信號(hào)通路,同時(shí)受到STAT3的調(diào)控[12];在靜脈注射組中,G-CSF的濃度有極顯著變化,可能是激活了NF-κ B信號(hào)通路;而在腹腔注射組中,G-CSF、IL-10、IL-12(p40)、IP-10、KC、TNF-α實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組血清中的濃度相比均有極顯著差異,說明腹腔注射作用的信號(hào)傳導(dǎo)途徑包括NF-κ B,MAPK,JAK/STAT 等[13-14]。
螺旋藻多糖經(jīng)腹腸黏膜系統(tǒng),它會(huì)與TLR2和TLR4結(jié)合形成化合物,然后刺激巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞激活一系列的信號(hào)傳遞,激活NF-κ B信號(hào)通路,啟動(dòng)先天免疫系統(tǒng),促進(jìn)發(fā)炎細(xì)胞因子的合成與分泌,合成的細(xì)胞因子再作用于一些免疫細(xì)胞,如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、N K細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、血小板、滑膜細(xì)胞等,形成一個(gè)復(fù)雜的免疫細(xì)胞之間的通訊網(wǎng)絡(luò)[15]。
總之,螺旋藻多糖作為一種無細(xì)胞毒性的免疫調(diào)節(jié)劑,能夠通過腸黏膜系統(tǒng)的受體相互作用,影響細(xì)胞因子的分泌,從而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)并發(fā)揮其多種生理功能。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果為其在功能性食品和其他一些領(lǐng)域的應(yīng)用提供了參考,并為其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)[16]。
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Spirulina platensisPolysaccharides Exert Immunoregulatory Effect through the Mucous Membranes of the Abdominal Cavity
CHANG Jing-yao,PANG Guang-chang*,LI Yang
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce,Tianjin 300134, China)
R151.41
A
1002-6630(2010)17-0281-05
2010-07-06
國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30871951)
常靜瑤(1985—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail:changjingyao128@163.com
*通信作者:龐廣昌(1956—),男,教授,博士,研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail:pgc@tjcu.edu.cn