Bacillus subtilisB2產1-脫氧野尻霉素(DNJ)發酵條件優化

朱運平，李秀婷，李里特

(1.北京工商大學化學與環境工程學院，北京 100048；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083)

Bacillus subtilisB2產1-脫氧野尻霉素(DNJ)發酵條件優化

朱運平1，李秀婷1，李里特2

(1.北京工商大學化學與環境工程學院，北京 100048；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083)

為探索制備含有1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojimycin，DNJ)的降血糖功能性食品的新方法，以產DNJ的菌株Bacillus subtilisB2為初始菌株，以價廉的農產品加工副產物豆渣為原料，通過對發酵條件的優化，獲得富含功能因子DNJ的發酵液。結果表明：接種量對α-葡萄糖苷酶抑制活性影響不明顯，當接種量大于104個/mL時，發酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性均在20以上。而豆渣濃度、發酵溫度、培養基初始pH值及發酵時間對發酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性影響較大，在豆渣質量濃度30mg/mL，初始pH值6～8，發酵溫度40℃的條件下發酵48h，發酵液表現出較高的α-葡萄糖苷酶抑制活性。以Bacillus subtilisB2發酵豆渣的發酵液為原料開發含DNJ的降糖功能食品，可以大大提高豆渣的利用價值，為降糖功能食品的開發利用開辟新途徑。

1-脫氧野尻霉素；Bacillus subtilisB2；豆渣；降血糖；功能性食品

Abstract：To prepare a fermentation broth rich in 1-deoxynojimycin (DNJ) available for the development of hypoglycemic functional foods containing DNJ using soybean dregs, a low-cost byproduct of agricultural products processing, as fermentation substrate andBacillus subtilisB2 as fermentation strain, some fermentation conditions were optimized. The results indicated that the effect of inoculum size on theα-glucosidase inhibitory activity of fermentation broth was not significant. An inoculum size above 104CFU/mL resulted in aα-glucosidase inhibitory activity above 20. However, fermentation substrate concentration,medium initial pH and fermentation temperature and time had substantial effect on theα-glucosidase inhibitory activity of fermentation broth. After fermentation for 48 h under the conditions of fermentation substrate concentration 30 mg/mL, medium initial pH 6 － 8 and 40 ℃, a maximumα-glucosidase inhibitory activity was obtained.

Key words：1-deoxynojimycin;Bacillus subtilisB2; soybean dregs; hypoglycemic function; functional food

1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojimycin，DNJ)是一種α-葡萄糖苷酶強抑制劑，在糖尿病的治療及預防過程中有著重要作用，是目前糖尿病治療用藥米格列醇的合成前體[1]。DNJ不僅在醫藥領域具有廣泛的應用前景，在食品領域的作用也日漸凸顯。天然植物資源中，桑類(桑芽、桑葉、桑皮、桑根、桑籽等)各個組織及全蠶粉均含有一定量的DNJ，具有明顯α-葡萄糖苷酶抑制效果，我國古代就把桑葉用于中醫保健[2-3]。近年來，日本等國已經允許以桑葉為原料的食品作為降血糖的功能性食品在市場上銷售[4]。但由于桑葉各個組織因DNJ含量的差異表現出對α-葡萄糖苷酶抑制效果存在一定的差異，同時，種植地區、桑樹的品種、生長階段都會對桑樹各組織中有效成分DNJ含量產生影響[5]，因此，以桑蠶類組織為原料生產降血糖功能性食品時，其有效成分DNJ的含量難以控制。

筆者在前期研究中發現從我國傳統發酵食品中分離得到的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisB2具有產DNJ的能力，進而提出了采用微生物發酵法制備含有DNJ的降血糖功能性食品的方法[6-7]。Bacillus subtilisB2產DNJ的最佳發酵條件有待進一步探索，因此，本實驗將對其發酵過程中的培養基濃度、初始pH值、發酵溫度、接種量、發酵時間等進行研究。

豆渣是大豆加工產品如豆奶或豆腐加工過程中的副產品，中國、阿根廷、巴西、美國、日本等國家每年豆渣的產量很大[8-10]。豆渣中含有多種功能性成分，如膳食纖維、大豆蛋白、多糖、異黃酮、皂苷等，具有豐富的營養價值[11]。但由于豆渣含水量較高、保質期短，這使得豆渣的利用受到一定的限制，大部分豆渣作為動物飼料直接喂養動物或者焚燒掉或者作為廢棄物堆放，不做任何利用，這造成了豆渣資源的極大浪費[12]。為了對豆渣進行綜合利用，本研究選取豆渣作為Bacillus subtilisB2的初始培養基。

1 材料與方法

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌(B.subtilisB2)由中國農業大學食品科學與營養工程學院李里特實驗室篩選。先在Luria-Bertani(LB)培養基上活化16h，調整菌液濃度至106個/mL，作為豆渣發酵的菌懸液。

1.2 材料與試劑

大豆(小粒6號，2009年7月收獲)購于吉林省農業科學院。以小粒6號大豆為原料在實驗室制備豆渣(水分含量85%、粗蛋白質量分數3.65%、粗脂肪質量分數1.37%、粗纖維質量分數9.22%、其他物質質量分數0.76%)。

α-葡萄糖苷酶(Rat intestinal acetone powders)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenylα-D-glucopyranoside，4-NPG) Sigma公司；其他化學試劑均為分析純。

1.3 發酵條件對發酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

1.3.1 豆渣質量濃度對發酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

以豆渣作為單一營養元素，對豆渣的添加濃度進行選擇，添加質量濃度分別為：10、20、30、40、50、60mg/mL。

1.3.2 培養基初始pH值對發酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

以0.1mol/L檸檬酸或氫氧化鈉溶液調節培養基的初始pH值為：5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，在上述培養條件下，搖瓶培養48h后測定α-葡萄糖苷酶抑制活性。

1.3.3 發酵溫度對發酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

采用不同溫度20、25、30、35、40、45、50℃對菌株進行搖瓶發酵培養，培養48h后測定α-葡萄糖苷酶抑制活性。

1.3.4 接種量對發酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

將種子培養液稀釋到一定濃度，使得培養基中菌種初始濃度為103、104、105、106、107個/mL，搖瓶培養48h后測定α-葡萄糖苷酶抑制活性。

1.3.5 發酵時間對發酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

發酵培養時間分別為：0、12、24、36、48、60、72、84、96h。測定發酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

1.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定[13]

因DNJ的含量與α-葡萄糖苷酶抑制活性存在正相關關系，因此，在發酵過程中通過檢測發酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性初步判斷DNJ的濃度。在96孔酶標板上，每個樣品經過7次連續2倍稀釋，得到一系列樣品稀釋液。經過稀釋的樣品中加入50μLα-葡萄糖苷酶溶液(25mg/mL)，50μL 4-PNPG (0.9133 mg/mL)及 120μL 0.5mol/L的磷酸緩沖液(pH6.7)。混勻后在37℃培養箱中反應45 min。加入50μL碳酸鈉溶液(0.67mol/L)終止反應，在波長405nm下用酶標儀(Model 550酶標儀，BIORAD Laboratories)測定吸光度。α-葡萄糖苷酶的抑制活性通過讀出的吸光度計算斜率值，用斜率表示抑制活性的高低。斜率越大，說明樣品的抑制活性越強，發酵液中有效成分DNJ的含量越高。

2 結果與分析

2.1 豆渣質量濃度對發酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

筆者在前期研究過程中，發現在LB培養基中添加豆渣、豆粉及淀粉這些附加培養物，發酵液的α-葡萄糖苷酶活性比單純用LB培養基顯著提高[6]。考慮到淀粉不適合作為餐后高血糖患者的飲食，因此，雖然淀粉能夠提高發酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性，還是建議盡量不向起始培養基中加入淀粉。大豆粉和豆渣也能顯著提高發酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性，考慮到豆渣的成本較大豆粉低很多，因此本研究中采用豆渣作為Bacillus subtilisB2發酵唯一營養源進行發酵，并試圖為豆渣的開發利用開辟一條新途徑。

從圖1可以看出，豆渣質量濃度對發酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響明顯，隨著豆渣質量濃度的增大，發酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性也隨之增加。豆渣質量濃度從10mg/mL增加到30mg/mL的過程中，發酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性從6.9迅速增加到21.8。當豆渣質量濃度高于30mg/mL時，繼續增大豆渣質量濃度，發酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性增加的速度放緩，最高抑制活性達到25.6。

圖1 豆渣質量濃度對發酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響Fig.1 Effect of soybean dregs concentration on theα-glucosidase inhibitory activity of fermentation broth

以豆渣為唯一營養源，即Bacillus subtilisB2生長的碳源及氮源均來源于豆渣。豆渣中含有24%左右的大豆蛋白可以作為菌體生長的良好氮源，大豆低聚糖、單糖等可以作為碳源[8,11]。同時，豆渣中含有豐富的纖維素，包括可溶性纖維和不溶性纖維，Bacillus subtilisB2在生長過程中可以水解部分纖維素成低聚糖或單糖，作為生長的碳源。本實驗中改變豆渣的濃度，也就是改變初始發酵液中碳源及氮源的濃度，這通常會對菌體生長及代謝產生較大的影響[14]。因此，豆渣濃度發生變化，發酵液的α-葡萄糖苷酶活性也會發生改變。

2.2 培養基初始pH值的影響

圖2 pH值對發酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響Fig.2 Effect of medium initial pH on theα-glucosidase inhibitory activity of fermentation broth

由圖2可見，培養基初始pH5時發酵液的抑制活性僅為1.2，幾乎沒有抑制活性。當培養基初始pH5.5時，發酵液對α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用，達到10.4。隨著培養基初始pH值的增加，發酵液的抑制作用也增強，當初始pH7時，抑制活性最高達到22.9。隨著培養基初始pH值進一步增加，發酵液抑制活性又逐漸下降，到pH10時，抑制活性為7.7。培養基初始pH值調節在酸性范圍內時，pH值的變化對抑制活性的影響顯著，在pH值低于5.5的環境下，最終發酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制活性也較低，這可能是因為低pH值容易抑制細菌的生長，進而影響其產生α-葡萄糖苷酶抑制因子的能力。在堿性范圍內，發酵液抑制活性的變化趨勢相對較緩慢。總的說來，初始pH值在6～8之間，發酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性較高，維持在18以上。

2.3 發酵溫度的影響

圖3 發酵溫度對發酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on theα-glucosidase inhibitory activity of fermentation broth

由圖3可見，40℃發酵所得發酵液對α-葡萄糖苷酶抑制活性最強，達到23.4。在30～45℃范圍內發酵液的抑制活性均較高，在14.7以上。但當溫度低于30℃及高于45℃時，發酵液的抑制活性降低很快，20℃及50℃時的抑制活性分別是最高抑制活性的31.3%和4.8%。在溫度較低的情況下，菌體生長緩慢，因此當發酵進行48h后發酵液的抑制活性仍然不高。本研究所用菌種為枯草芽孢桿菌，就菌種本身來說因其具有芽孢，是能夠耐受高溫的，但本實驗發現當溫度增到50℃時，發酵液的抑制活性就顯著降低，這可能是因為：枯草芽孢桿菌雖然能在高溫環境下存活，但其正常的生長繁殖能力卻受到高溫條件的影響而降低，另一方面，高溫環境也可能會改變正常菌株合成α-葡萄糖苷酶抑制因子的能力[15]。

2.4 接種量的影響

圖4 接種量對發酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響Fig.4 Effect of inoculum size on theα-glucosidase inhibitory activity of fermentation broth

由圖4可見，當接種量大于104個/mL時，發酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性均在20以上，不同的接種量對抑制活性影響差別不大，當接種量為103個/mL時，發酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性不高，為最高抑制活性的70%，說明接種量103個/mL太小，一定程度上影響了菌株的生長及α-葡萄糖苷酶抑制因子的生成。在后續實驗中將選擇接種量106個/mL。

2.5 發酵時間的影響

圖5 發酵時間對發酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響Fig.5 Effect of fermentation time on theα-glucosidase inhibitory activity of fermentation broth

由圖5可見，當發酵進行到12h時，發酵液具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，隨著發酵時間的延長，抑制活性也增加，發酵進行到48h時，抑制活性達到22.8，進一步延長發酵時間，抑制活性增長速度緩慢。發酵進行到96h時，抑制活性達24.3。

3 結 論

本研究對Bacillus subtilisB2產DNJ的液體發酵條件進行研究，結果表明：豆渣濃度、發酵溫度、培養基初始pH值及發酵時間對發酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性影響較大。在豆渣質量濃度30mg/mL，初始pH6～8，發酵溫度40℃的條件下發酵48h，發酵液表現出較高的α-葡萄糖苷酶抑制活性，即發酵液中DNJ含量較高。在本研究結果的基礎上，有望通過進一步研究得到含穩定有效降血糖成分的功能性食品。同時，將發酵豆渣開發成特殊用途的食品，可以大大提高豆渣的利用價值，為豆渣的開發利用開辟新途徑。

[1] de MELO E B, da SILVEIRA GOMES A, CARVALHO I.α- andβglucosidase inhibitors:chemical structure and biological activity[J].Tetrahedron, 2006, 62(44):10277-10302.

[2] 杜仲爭, 陳杰, 陳偉華, 等. 全蠶粉(SP)降血糖的作用效果及其機理的研究[J]. 蠶業科學, 2001, 27:114-118.

[3] 杜仲爭, 戴建一, 陳軍建, 等. 全蠶粉的食用價值及其降血糖的臨床試驗效果[J]. 蠶業科學, 2004, 30:107-110.

[4] KIMURA T, NAKAGAWA K, SAITO Y, et al. Simple and rapid determination of 1-deoxynojirimycin in mulberry leaves[J]. Biofactors,2004, 27:341-345.

[5] KIMURA T, NAKAGAWA K, KUBOTA H, et al. Food-grade mulberry powder enriched with 1-deoxynojirimycin suppresses the elevation of postprandial blood glucose in humans[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55:5869-5874.

[6] ZHU Yunping, YIN Lijun, CHENG Yongqiang, et al. Effects of sources of carbon and nitrogen on production ofα-glucosidase inhibitor by a newly isolated strain ofBacillus subtilisB2[J]. Food Chemistry, 2008,109(4):737-742.

[7] ZHU Yunping, YAMAKI K, YOSHIHASHI T, et al. Purification and identification of 1-deoxynojirimycin (DNJ) in okara fermented byBacillus subtilisB2 from Chinese traditional food (Meitaoza)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(7):4097-4103.

[8] van der RIET W B, WIGHT A W, CILLIERS J J L, et al. Food chemical investigation of tofu and its byproductokara[J]. Food Chemistry,1989, 34:193-202.

[9] 朱運平, 程永強, 劉海杰, 等. 不同菌種發酵豆渣產α-葡萄糖苷酶抑制因子的研究[J]. 中國糧油學報, 2008, 23(4):70-74.

[10] 朱運平, 程永強, 汪立君, 等. 發酵豆渣的功能性及應用研究現狀[J].食品科學, 2008, 29(5):475-479.

[11] O’TOOLE D K. Characteristics and use of okara, the soybean residue from soy milk production [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1997, 47:363-371.

[12] 朱運平, 李里特. 豆渣的營養功能特性[J]. 營養健康新觀察, 2006(2):47-49.

[13] YAMAKI K, MORI Y. Evaluation of alpha-glucosidase inhibitory activity in colored foods:A trial using slope factors of regression curves[J].Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi, 2006, 53:229-231 (in Japanese).

[14] ZHENG Yuguo, XUE Yaping, SHEN Yinchu. Production of valienamine by a newly isolated strain:Stenotrophomonas maltrophilia[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 39:1060-1065.

[15] STEIN D C, KOPEC L K, YASBIN R E, et al. Characterization ofBacillus subtilisDSM704 and its production of 1-deoxynojirimycin[J].Applied and Environmental Microbiology, 1984, 48(2):280-284.

Optimization of Fermentation Conditions for 1-Deoxynojimycin (DNJ) Production byBacillus subtilisB2

ZHU Yun-ping1，LI Xiu-ting1，LI Li-te2
(1. School of Chemical and Environmental Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China；2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

TQ920.1

A

1002-6630(2010)17-0290-04

2010-06-09

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAD27B09)；北京工商大學青年啟動基金項目；北京市優秀人才項目；國家自然科學基金項目(31071511)

朱運平(1980—)，女，講師，博士，研究方向為功能性食品。E-mail：zhuyp@th.btbu.edu.cn