醬油制曲過程中蛋白酶和谷氨酰胺酶活力影響因素

馬永強，宮安旭,*，陳曉昕，孫冰玉

(1. 哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076；2. 哈爾濱正陽河調味食品有限公司，黑龍江 哈爾濱 150025)

醬油制曲過程中蛋白酶和谷氨酰胺酶活力影響因素

馬永強1，宮安旭1,*，陳曉昕2，孫冰玉1

(1. 哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076；2. 哈爾濱正陽河調味食品有限公司，黑龍江 哈爾濱 150025)

在醬油制曲過程中通過單因素試驗分別探討制曲過程中預處理條件和制曲條件對蛋白酶和谷氨酰胺酶比活力的影響，通過正交試驗確定制曲過程中對酶比活力影響的各因素的重要性次序和最佳工藝參數組合。影響蛋白酶比活力的重要性次序為：接種量＞制曲時間＞制曲溫度；酶比活力最高的制曲工藝參數組合為：接種量0.8%、制曲溫度32℃、制曲時間36h；影響谷氨酰胺酶比活力的重要性次序為：制曲溫度＞制曲時間＞接種量；酶比活力最高的制曲工藝參數組合為：接種量0.5%，制曲時間60h，制曲溫度28℃。

醬油制曲；蛋白酶；谷氨酰胺酶；米曲霉

Abstract：In the present study, a series of single factor experiments were conducted to examine the effects of pretreatment and inoculation conditions on protease and glutamine activities during soy sauce koji processing. This was followed by the investigations on importance order of these conditions and their optimum values using orthogonal array design. The results showed that the importance order of process conditions affecting protease activity was:inoculum size＞fermentation time＞fermentation temperature and the optimum conditions for maximizing protease activity were as follows:inoculum size 0.8%, fermentation temperature 32 ℃ and fermentation time 36 h; and the importance order of process conditions affecting glutamine activity was:fermentation temperature＞fermentation time＞inoculum size and the optimum conditions for maximizing glutamine activity were as follows:noculum size 0.5%, fermentation temperature 28 ℃ and fermentation time 60 h.

Key words：soy sauce koji；protease；glutaminase；Aspergillus oryzae

醬油制曲過程中米曲霉產酶活力的高低將影響原料的利用率及產品的品質，因此提高成曲酶活力是提高醬油品質的一條重要途徑[1]。醬油廠家一般采用大豆或豆粕作醬油生產的蛋白質原料[2-3]。通過蛋白酶的作用，大豆或豆粕等蛋白質原料中的蛋白質得以被酶解為氨基酸，并產味、產色和產香，形成獨特的醬油產品特征，從而提高醬油的品質[4-5]。日本醬油行業的蛋白質利用率已經達到92%，而我國只有65%～72%，有的甚至低至55%[6]。同時醬油風味物質的研究在歐美國家也日益受到了重視[7]。

在制曲過程中以蛋白酶活力、谷氨酰胺酶為主要指標，通過改變不同的制曲條件，測定蛋白酶比活力、谷氨酰胺酶比活力，研究成曲的優化。探討不同影響因素對酶比活力的影響以及應用中比較合理的使用辦法，以得到醬油的最佳制曲條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆粕、麩皮、木薯粉 市售。

米曲霉菌種由哈爾濱商業大學食品學院提供。

碘化鉀、二氯化汞、氫氧化鉀、氯化銨、酒石酸鉀鈉、甲醛、L-谷氨酰胺均為分析純。

1.2 儀器與設備

SP-721E分光光度計 上海光譜儀器有限公司；202型恒溫培養箱 余姚市東方電工儀器廠；H-4數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；ZDX-35D高壓滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；78-1型磁力攪拌器 上海一恒科學儀器有限公司；FA2004N 型電子分析天平 上海精密科技儀器有限公司；E-201-C型 pH計 上海精科實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 醬油制曲的工藝流程[8-9]

圖1 醬油制曲工藝流程Fig.1 Flow chart for soy sauce koji processing

1.3.2 菌種活化

將米曲霉菌種接種在試管斜面培養基上，30℃培養6d備用。然后轉接種于5°Be米曲汁液態培養基培養。

1.3.3 酶比活力的測定

蛋白酶比活力測定采用改良甲醛法[10]。1g成曲在55℃，自然pH值條件下，1min內水解大豆粉產生1μg氨基酸態氮定義為一個酶活力單位。

谷氨酰胺酶比活力測定參照文獻[11-14]進行。在37℃，pH 6.0條件下每小時催化谷氨酰胺產生1μmol NH3定義為一個酶活力單位。

1.3.4 制曲工藝的單因素試驗

1.3.4.1 蒸料時間對酶比活力的影響

分別選取蒸料時間為20、25、30、35min，在干料加水質量分數70%、接種量為0.8%、制曲溫度32℃、制曲時間48h時對成曲進行感官檢驗并檢測成曲的蛋白酶比活力、谷氨酰胺酶比活力。

1.3.4.2 接種量對酶比活力的影響

分別選取接種量為0.5%、0.8%、1.0%、1.5%，在干料加水量70%、蒸料時間30min、制曲溫度32℃、制曲時間48h時對成曲進行感官檢驗并檢測成曲的蛋白酶比活力、谷氨酰胺酶比活力。

1.3.4.3 制曲時間對酶比活力的影響

分別選取制曲時間為36、48、60、72h，在干料加水量70%、蒸料30min、接種量為0.8%、制曲溫度32℃、制曲時間48h時對成曲進行感官檢驗并檢測成曲的蛋白酶比活力、谷氨酰胺酶比活力。

1.3.4.4 制曲溫度對酶比活力的影響

分別選取制曲溫度為28、30、32、35℃，在干料加水量70%、蒸料時間30min、接種量為0.8%、制曲時間48h時對成曲進行感官檢驗并檢測成曲的蛋白酶比活力、谷氨酰胺酶比活力。

1.3.5 制曲條件的正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選取接種量、制曲時間、制曲溫度進行正交試驗，其水平分別選擇0.8%、48h、32℃左右。以成曲的蛋白酶比活力、谷氨酰胺酶比活力為評判指標作L9(34)正交試驗，其因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

2 結果與分析

2.1 蒸料時間對酶比活力的影響

觀察1.3.4.1節試驗現象，檢測米曲霉生長情況與蛋白酶比活力、谷氨酰胺酶比活力，結果見表2。

表2 蒸料時間對米曲霉生長情況及酶比活力的影響Table 2 Effect of steaming time onAspergillus oryzaegrowth and protease and glutamine activities

由表2可見，蒸料時間30min時蛋白酶、谷氨酰胺酶比活力均達到最大值，可見原料在30min時蛋白質基本完全變性。蒸料時間過短，淀粉和蛋白的熟化度不夠。未變性的和過度變性的蛋白質變成非水溶性的，酶不能將其分解，且會形成褐色素從而降低原料利用率。蒸料時間過長，會增加蒸汽能耗，成本上升，且容易使蛋白質過度變性，米曲霉生長所需的有效營養物減少，使蛋白酶、谷氨酰胺酶活力降低。

2.2 接種量對酶比活力的影響

觀察1.3.4.2節試驗現象，檢測米曲霉生長情況與蛋白酶比活力、谷氨酰胺酶比活力，結果見表3。

表3 接種量對米曲霉生長情況及酶比活力的影響Table 3 Effect of inoculum size onAspergillus oryzaegrowth and protease and glutamine activities

由表3可以看出，在接種量為0.8%時蛋白酶比活力達到最大；接種量為1.0%時谷氨酰胺酶比活力達到最大。接種量由1.0%增加到1.5%時，谷氨酰胺酶比活力出現下降趨勢，由于接種量增加，菌體生長達到對數期的時間提前，所以相同酶活力單位出現時間提前，導致在相同的時間酶比活力降低。

2.3 制曲時間對酶比活力的影響

觀察1.3.4.3節試驗現象，檢測米曲霉的生長情況與蛋白酶比活力、谷氨酰胺酶比活力，結果見表4。

表4 制曲時間對米曲霉生長情況及酶比活力的影響Table 4 Effect of fermentation time onAspergillus oryzaegrowth and protease and glutamine activities

由表4可見，制曲時間36h時，孢子處于生長旺盛期，達到最大值。隨著制曲時間的延長，米曲霉孢子進入生長后期，蛋白酶比活力開始呈緩慢下降的趨勢。而谷氨酰胺酶屬于胞內酶，由于開始生長，在成曲中谷氨酰胺酶含量較少，但隨著培養時間的延長，孢子飛揚、破裂，在成曲中胞內酶含量增加，當培養時間達到60h時，酶比活力最高，隨著培養時間延長孢子進入生長后期，酶比活力大大降低。米曲霉生長需要一定的時間，要經歷孢子發芽期、孢子繁殖期、孢子生長后期3個階段，通常32～40h即可以保證孢子充分生長。

2.4 制曲溫度對酶比活力的影響

觀察1.3.4.3節試驗現象，檢測米曲霉的生長情況與蛋白酶比活力、谷氨酰胺酶比活力，結果見表5。

由表5可見，制曲溫度在28～35℃內，蛋白酶、谷氨酰胺酶比活力逐漸下降，28℃時蛋白酶、谷氨酰胺酶比活力達到最大。在28℃時，米曲霉活力最好，產酶效率最高，菌種里的米曲霉在制曲中起主要作用，故溫度應選在米曲霉易于生長的范圍，盡量做到低溫制曲。

表5 制曲溫度對米曲霉生長情況及酶比活力的影響Table 5 Effect of fermentation time onAspergillus oryzaegrowth and protease and glutamine activities

2.5 正交試驗結果與分析

表6 L9(34)正交試驗結果分析表Table 6 Orthogonal array layout and experimental results

由表6可見，影響蛋白酶比活力的各因素重要次序為：A＞C＞B，即：接種量＞制曲時間＞制曲溫度；最佳工藝參數組合為：接種量0.8%，制曲時間36h，制曲溫度32℃。影響谷氨酰胺酶比活力的各因素重要次序為：C＞A＞B，即：制曲時間＞接種量＞制曲溫度。最佳工藝參數組合為：制曲時間60h，制曲溫度28℃，接種量0.5%，由于正交試驗沒有此條件下的酶比活力，因此，進行再次驗證實驗，測得谷酰胺酶比活力為2.21U/g。

3 結 論

醬油制曲過程中蒸料時間、接種量、制曲溫度、制曲時間對成曲品質指標(蛋白酶比活力、谷氨酰胺酶比活力)均具有影響。

通過正交試驗得到以蛋白酶比活力為指標的最佳參數組合為：蒸料30min、接種量0.8%、制曲時間36h、制曲溫度32℃。以谷氨酰胺酶比活力為指標的最優條件分別為：蒸料時間30min、制曲時間60h、接種量0.5%、制曲溫度28℃。但是由于谷氨酰胺酶只有在自溶后才能發揮作用，尤其在制曲過程中比活力較低，所以谷氨酰胺酶比活力指標在應用過程中不能充分發揮作用，而主要在制曲后的醅發酵過程中其比活力才有更大的作用，因此在制曲過程中主要考慮蛋白酶比活力，選用蛋白酶比活力為指標的最佳參數組合為：接種量0.8%、制曲時間36h、制曲溫度32℃。

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Affecting Factors of Protease and Glutaminase Activities during Soy Sauce Koji Processing

MA Yong-qiang1，GONG An-xu1,*，CHEN Xiao-xin2，SUN Bing-yu1
(1. College of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China；2. Zhengyang River Seasoning Food Co. Ltd., Harbin 150025, China)

TS264.2

A

1002-6630(2010)17-0294-04

2010-06-29

馬永強(1963—)，男，教授，碩士，研究方向為食品化學、食品生物技術。E-mail：mayq@hrbcu.edu.cn

*通信作者：宮安旭(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：abcdtiancai@163.com