真姬菇液體菌種培養基篩選和搖瓶發酵條件的研究

王麗娟，劉林德，卜慶梅，王愛云，王淑芳

(魯東大學生命科學學院，山東 煙臺 264025)

真姬菇液體菌種培養基篩選和搖瓶發酵條件的研究

王麗娟，劉林德，卜慶梅，王愛云，王淑芳

(魯東大學生命科學學院，山東 煙臺 264025)

采用搖瓶培養法對真姬菇液體菌種培養基篩選和發酵條件進行研究。研究表明，真姬菇液體菌種最佳組合培養基為：葡萄糖3g/100mL、玉米淀粉1g/100mL、黃豆粉1.5g/100mL、(NH4)2SO40.3g/100mL、KH2PO40.2g/100mL、MgSO4·7H2O 0.1g/100mL和VB110mg/L。真姬菇搖瓶發酵最佳條件為：起始pH值為6.0，500mL錐形瓶裝液量140～150mL，搖床轉速180r/min，溫度26℃，二級搖瓶發酵時間72h，接種量10%～12%。

真姬菇；培養基篩選；發酵條件

Abstract：In this study, medium composition and process conditions for the liquid-state incubation ofHypsizigus marmoreusin a shake flask were explored. The optimal medium composition was found to consist of 3 g/100 mL glucose, 1 g/100 mL corn starch, 1.5 g/100 mL soybean cake, 0.3 g/100 mL (NH4)2SO4, 0.2 g/100 mL KH2PO4, 0.1 g/100 mL MgSO4·7H2O and 10 mg/L Vitamin B1. Initial pH of 6.0, medium volume contained in a 500 mL flask of 140－150 mL, shaking speed of 180 r/min, incubation temperature of 26 ℃, incubation time of 72 h and inoculum size of 10%－12% were found optimal.

Key words：Hypsizigus marmoreus；medium selection；incubation conditions

真姬菇(Hypsizigus marmoreus)又名玉蕈、蟹味菇，隸屬擔子菌亞門層菌綱傘菌目白蘑科玉蕈屬[1]。真姬菇是一種珍稀名貴食用菌，它含有豐富的蛋白質、氨基酸和維生素，具有高蛋白、低脂肪、低熱量的特點。真姬菇子實體蛋白質具有較高的營養價值，氨基酸評分(AAS)、化學評分(CS)、營養指數(NI)和氨基酸比值系數分(SRCAA)4項指標均比參比食用菌高[2]。同時，真姬菇是一種深受消費者青睞的保健食品。真姬菇多糖等提取物具有較好的清除超氧自由基和羥自由基活性，經常食用具有提高人體免疫力、預防衰老、延長壽命的功效[3-6]。

中國從20世紀80年代起對真姬菇開展生物學特性和栽培條件研究[7-10]。但目前的栽培大多沿用傳統的固體菌種接種方法，萌發速度慢，易污染，生產周期長，經濟效益低。用液體菌種接種，菌絲球數量多，萌發點多，生長速度快，不宜污染，周期短，成本低，適宜工廠化栽培，有著廣闊的前景。近年來有關真姬菇等液體培養基的篩選已有研究[11-15]，但以發酵菌絲為目的用于真姬菇液體菌種生產的有關研究只見少量報道[16]。本實驗以菌絲體干質量濃度為指標，篩選適宜真姬菇液體菌種生長的液體培養基和培養條件，旨在為大規模栽培真姬菇提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

真姬菇(Hypsizigus marmoreus)由山東省食用菌工作站提供。

1.2 基礎培養基

葡萄糖3g/100mL、蛋白胨1g/100mL、KH2PO40.2g/100mL、MgSO4·7H2O 0.1g/100mL、VB110mg/L。

1.3 一級搖瓶培養基

葡萄糖3g/100mL、麩皮4g/100mL、土豆20g/100mL、KH2PO40.2g/100mL、MgSO4·7H2O 0.1g/100mL、VB110mg/L。

1.4 測定方法

菌絲體干質量的測定：發酵液經雙層紗布過濾后，菌絲體用水沖洗干凈，60℃烘箱中烘干至質量恒定，稱其質量，重復3次。菌球密度的測定：取1mL培養液于培養皿中，在培養皿下面放一張黑白相間的格子紙，然后進行計數，重復3次。菌球直徑的測定：隨機取15個菌球，在培養皿中排成一列，測其總長度，求平均值。

1.5 搖瓶發酵條件的設定

設定不同的裝液量、起始pH值和接種量。裝液量選用500mL三角瓶，裝液量分別為100、120、140、160、180、200mL；起始pH值分別為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5；接種量(V/V)分別為3%、6%、9%、12%、15%、18%。

設定不同的培養溫度、搖床轉速和培養時間。培養溫度分別為15、18、21、24、27、30℃；搖床轉速分別為100、120、140、160、180、200r/min；培養時間分別為48、72、96、120、144、168h。

2 結果與分析

2.1 培養基成分對菌絲體干質量的影響

2.1.1 碳源篩選試驗

基礎培養基中的碳源分別是3g/100mL的葡萄糖、蔗糖、紅糖、白糖、玉米淀粉、小麥粉、玉米粉，以及20g/100mL的土豆、麩皮。以無碳源基礎培養基為對照，測定菌絲體干質量，結果見表1[17-18]。

表1 不同碳源對菌絲體干質量的影響Table 1 Effect of carbon source type onHypsizigus marmoreusmycelial biomass

從表1可以看出，在供試的10種培養基中，真姬菇以葡萄糖為碳源時，菌絲體干質量最大；在含淀粉較多的碳源培養基中，以玉米淀粉為碳源時，菌絲體干質量最大。因此，選用葡萄糖和玉米淀粉作為碳源比較適宜。

2.1.2 氮源篩選試驗

將基礎培養基中的氮源分別換成2g/100mL的蛋白胨、麩皮、黃豆粉、花生餅、干酪素、玉米糠及0.2g/100mL的尿素、硫酸銨、硝酸鐵。以無氮源基礎培養基為對照，測定菌絲體干質量。結果見表2。

表2 不同氮源對菌絲體干質量的影響Table 2 Effect of nitrogen source type onHypsizigus marmoreusmycelial biomass

從表2可以看出，有機氮中真姬菇以黃豆粉為氮源時，菌絲體干質量最大；在無機氮中以硫酸銨為氮源時菌絲體干質量最大。因此，選擇黃豆粉和硫酸銨為氮源較適宜。

2.1.3 培養基成分綜合試驗

根據菌絲生長對碳氮利用的特點，將有機氮源、無機氮源、易利用碳源和相對較難利用碳源相互組合，選用黃豆粉、硫酸銨、葡萄糖和玉米淀粉，在去碳源和氮源基礎培養基中按試驗設計分別加入碳源和氮源，進行L9(34)正交試驗，測定菌絲體干質量，其結果見表3、4。

表3 正交試驗因素水平設計表Table 3 Factors and levels in the orthogonal array design

從表4可以看出，以菌絲體干質量濃度為指標，4個因素對菌絲體干質量的影響主次順序為A＞C＞B＞D。葡萄糖質量濃度越大，菌絲體干質量濃度越高，以葡萄糖3g/100mL的菌絲體干質量濃度為最高；玉米淀粉1g/100mL時菌絲體干質量濃度最高；黃豆粉1.5g/100mL時菌絲體干質量濃度最高，硫酸銨0.3g/100mL時菌絲體干質量濃度最高。所以最佳組合為A3B1C3D3，即葡萄糖3g/100mL、玉米淀粉1g/100mL、黃豆粉1.5g/100mL和(NH4)2SO40.3g/100mL。但此正交試驗設計中未出現此最佳組合，因此進行驗證實驗。在此組合條件下，菌絲體干質量為1.950g/100mL，在正交試驗其他組合的結果中為最高，因此最佳組合為A3B1C3D3。用最佳組合及微量成分KH2PO40.2g/100mL、MgSO4·7H2O 0.1g/100mL和10mg/L VB1配合即為真姬菇最佳液體培養基。

表4 L9(34)正交試驗結果Table 4 Orthogonal array layout and experimental results

2.2 不同發酵條件對菌絲體干質量的影響

2.2.1 培養基起始pH值對菌絲體干質量的影響

絕大多數食用菌適宜在微酸性環境中生長。本研究在確定培養基成分的基礎上，在裝液量150mL、接種量12%、溫度24℃、搖床轉速150r/min的條件下培養4d，設定6個不同的pH值。結果表明：菌絲在pH3.0～8.0范圍內均能生長；當pH4.0～6.0時，菌絲體干質量一直呈上升趨勢；當pH值為5.5時，菌絲體干質量最大；繼續提高pH值，菌絲體干質量逐漸減少(圖1)。因此確定真姬菇的最適起始pH值在6.0左右。

圖1 培養基起始pH值對菌絲體干質量的影響Fig.1 Effect of medium initial pH onHypsizigusmarmoreusmycelial biomass

2.2.2 裝液量對菌絲體干質量的影響

在pH6.0、接種量12%、溫度24℃、搖床轉速150r/min的條件下培養4d，選擇500mL三角瓶，裝液量分別為100、120、140、160、180、200mL。圖2顯示160mL裝液量菌絲體干質量最高，因此選擇150mL進行發酵較適宜。

圖2 裝液量對菌絲體干質量的影響Fig.2 Effect of medium volume contained in a 500 mL flask onHypsizigus marmoreusmycelial biomass

2.2.3 接種量對菌絲體干質量的影響

在pH6.0、裝液量150mL、溫度24℃、搖床轉速150r/min的條件下，選擇接種量分別為3%、6%、9%、12%、15%、18%。發酵4d后，測定菌絲體干質量。由圖3可知，接種量以9%～12%為宜，因此最佳接種量選擇10%為宜。

圖3 接種量對菌絲體干質量的影響Fig.3 Effect of inoculum size onHypsizigus marmoreusmycelial biomass

2.2.4 溫度對菌絲體干質量的影響

圖4 溫度對菌絲體干質量的影響Fig.4 Effect of incubation temperature onHypsizigus marmoreusmycelial biomass

在pH6.0、裝液量150mL、接種量10%、搖床轉速150r/min的反應條件下發酵4d，設定6個不同的溫度進行篩選試驗。溫度分別設定15、18、21、24、27、30℃。圖4顯示，隨溫度的升高菌絲量不斷增加，24℃時菌絲量最高，24～27℃菌絲量差異不明顯，27℃時菌絲體干質量逐漸下降，因而確定24～26℃為最適溫度。

2.2.5 搖床轉速對菌絲體干質量和菌球直徑的影響

在pH6.0、裝液量150mL、接種量10%、溫度26℃的條件下，設定轉速分別為100、120、140、160、180、200r/min發酵4d，其結果見圖5。

圖5 轉速對菌絲體干質量的影響Fig.5 Effect of shaking speed onHypsizigus marmoreusmycelial biomass

如圖5所示，轉速加快，通氣量增大，菌絲體干質量增加；轉速達180r/min時，菌絲球直徑變小，均勻一致，菌絲體干質量最大；當轉速超過180r/min，片狀增多，大小不一，菌絲體干質量下降。因此在搖床轉速180r/min下培養較合適。

2.2.6 培養時間對菌絲體干質量的影響

在pH6.0、裝液量150mL、接種量10%、溫度26℃、轉速180r/min的條件下，分別培養48、72、96、120、144、168h。從圖6可以看出，培養至96h時菌絲體干質量最高。

圖6 培養時間對菌絲體干質量的影響Fig.6 Effect of incubation time onHypsizigus marmoreusmycelial biomass

3 結 論

3.1 真姬菇對碳源的利用較為廣泛，對單糖、寡聚糖、多糖都能利用；但對單糖的利用最好。有機氮比無機氮更利于菌絲生長。本研究篩選的最佳配方可使菌絲體干質量達1.950g/100mL，高于有關資料的報道，并且菌球數量多，體積小，比較適合用作菌種。

3.2 適宜真姬菇液體培養的條件是：起始pH值為6.0，500mL錐形瓶裝液量為140～150mL，搖床轉速為180r/min，溫度為26℃，二級搖瓶發酵時間為96h。但二級搖瓶選擇發酵時間選擇為72h的菌齡。雖然72h菌齡的菌絲體干質量比96h菌齡的低，但菌絲正處于生命力極為旺盛的對數生長期，接種后，有利于菌絲生長。

3.3 接種量對菌絲生長有重要影響，接種量大可縮短發酵延遲期。但接種量過大，往往使菌絲生長過快，培養液黏度增加，造成溶氧不足而影響菌絲生長。因此真姬菇液體發酵一般以10%～12%的接種量為宜。

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Screening of Optimal Liquid Medium forHypsizigus marmoreusand Optimization of Its Shake Flask Incubation Conditions

WANG Li-juan，LIU Lin-de，BU Qing-mei，WANG Ai-yun，WANG Shu-fang
(School of Life Sciences, Ludong University, Yantai 264025, China)

Q93.335；S646

A

1002-6630(2010)17-0323-04

2010-06-27

王麗娟(1972—)，女，講師，碩士，研究方向為生物教育學、微生物學。E-mail：wanglijuan53@126.com