外界因素對重組Enterocin A抗菌活性的影響

趙愛珍，徐興然，韓文瑜

(1.西南大學藥學院，重慶 400715；2.吉林大學畜牧獸醫學院，吉林 長春 130062)

外界因素對重組Enterocin A抗菌活性的影響

趙愛珍1，徐興然1，韓文瑜2

(1.西南大學藥學院，重慶 400715；2.吉林大學畜牧獸醫學院，吉林 長春 130062)

探討蛋白酶、還原劑、溫度、pH值4個外界因素對Enterocin A抗菌活性的影響。對重組Enterocin A進行不同處理后，采用瓊脂孔擴散實驗、瓊脂點種實驗或者平板菌落計數法檢測樣品的抗李斯特菌活性。結果表明：重組Enterocin A的蛋白酶消化產物的抗菌活性喪失，其β-巰基乙醇還原產物的抗菌活性也喪失；重組Enterocin A表現較高的熱穩定性，100℃處理10min后仍可以檢測到抗菌活性；該重組細菌素在pH2.0～8.0條件下均保持抗菌活性。

重組Enterocin A；抗李斯特菌活性；外界因素

Abstract：With and without sole exposures to proteases (trypsin and protease K), reductant (2-mercaptoethanol), temperature and pH, recombinant Enterocin A was tested for its anti-ListeriaLIN 3 activity by agar diffusion, agar spot or plate count methods in order to figure out the effects of these external factors on this biological activity. Due to protease hydrolysis, recombinant Enterocin A thoroughly lost its anti-ListeriaLIN 3 activity. The presence ofβ-mercaptoethanol also resulted in a near-complete loss of its anti-ListeriaLIN 3 activity. Recombinant Enterocin A presented high thermal stability. In spite of heating for 10 min at 100 ℃, its anti-ListeriaLIN 3 activity could still be detected. Recombinant Enterocin A could maintain anti-ListeriaLIN 3 activity in the pH range from 2.0 to 8.0.

Key words：recombinant Enterocin A；anti-ListeriaLIN 3 activity；external factors

Enterocin A是屎腸球菌產生的細菌素之一，表現抗單核細胞增生李斯特菌等多種李斯特菌及一些乳酸菌的活性，具有作為食品添加劑的內在條件[1-3]。除抗菌活性，穩定性也是細菌素作為食品添加劑所需要的條件之一。天然細菌素產生量少且獲得過程比較復雜，不利于對其進行廣泛而深入的研究。利用細菌素的多肽特性，研究人員已通過大腸桿菌表達系統獲得了一些具有生物學活性的重組細菌素[4-5]。本課題組也成功利用大腸桿菌表達系統融合表達Enterocin A，而且所獲得的重組Enterocin A具有抗李斯特菌活性[6]。該重組Enterocin A不僅比較容易獲得，而且結構與抗菌活性均接近天然Enterocin A。本研究擬探討蛋白酶、還原劑、溫度、pH值4個外界因素對該重組Enterocin A抗菌活性的影響，為Enterocin A在食品中的合理應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑、菌種與培養基

重組Enterocin A純化樣品(pH6.5) 本課題組制備[6]；胰蛋白酶、蛋白酶K、β-巰基乙醇(β-ME) 上海生工生物工程技術服務有限公司。

無害李斯特菌LIN3(指示菌) 本實驗室保存。

胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(TSA)按照常規方法配制。

1.2 儀器與設備

HH-6數控恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養箱 上海齊欣科學儀器有限公司；PHS-3C型pH計 上海精密科學儀器有限公司；CF16RX型高速冷凍離心機 日本日立公司。

1.3 樣品處理

1.3.1 蛋白酶消化

用1mol/L NaOH溶液將重組Enterocin A樣品由pH6.5調整為pH7.0，分別加入胰蛋白酶、蛋白酶K至終質量濃度為0.5mg/mL，37℃水浴2～4h，同時以未經酶處理的樣品作為對照。

1.3.2 β-巰基乙醇處理

將重組Enterocin A樣品分為兩份，每份1mL：一份加入β-巰基乙醇至終濃度為50mmol/L，另一份不加β-巰基乙醇，37℃水浴10min。LB培養基作為陰性對照進行同樣的處理。4份樣品分別加入1mL無害李斯特氏菌LIN3懸浮液(約600CFU/mL)，25℃培養1h后，6000r/min、4℃離心10min，將菌體重新懸浮于PBS緩沖液(pH7.0)中。每份樣品設定3個重復實驗。

1.3.3 熱處理

將重組Enterocin A樣品在不同的溫度(60、80℃和100℃)分別水浴10、30min和60min，立即將熱處理樣品冰浴，同時以未處理的樣品作為對照。

1.3.4 pH值調整

用1mol/L NaOH溶液或者1mol/L HCl溶液調整重組Enterocin A樣品的pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，同時以相同pH值的PBS緩沖液作為對照。

1.4 抗菌活性檢測

通過瓊脂孔擴散實驗[7]檢測蛋白酶消化樣品的抗李斯特菌活性；通過瓊脂點種實驗[8]測定重組Enterocin A的細菌素活性、熱處理樣品或者不同pH值樣品的抗菌活性；通過平板菌落計數法測定培養物中的活菌數[9]。

2 結果與分析

2.1 重組Enterocin A的活性定量

圖1 重組Enterocin A的活性測定Fig.1 Anti-ListeriaLIN 3 activity of serial binary dilutions of recombinant Enterocin A

以無害李斯特氏菌LIN3作為指示菌，重組Enterocin A純化樣品的細菌素活性測定結果見圖1。1個細菌素單位(BU)定義為點種10μL稀釋樣品后能夠形成直徑至少為2mm的明顯抗菌圈的最高稀釋度的倒數，樣品的細菌素活性=(1/稀釋度)×100，單位為BU/mL。由圖1可知，稀釋度為1/24的樣品能夠形成明顯抗菌圈，則重組Enterocin A樣品的細菌素活性為1600BU/mL。

2.2 蛋白酶對重組Enterocin A抗菌活性的影響

圖2 蛋白酶對重組Enterocin A抗菌活性的影響Fig.2 Effects of proteases on anti-ListeriaLIN 3 activity of recombinant Enterocin A

經胰蛋白酶、蛋白酶K處理2h后，重組Enterocin A的抗菌活性喪失，而未處理樣品的抗菌活性保持不變(圖2)。多肽特性決定了細菌素的蛋白酶敏感性，天然Enterocin A表現對多種蛋白酶例如α-胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K敏感[10]。由圖2可知，重組Enterocin A對胰蛋白酶、蛋白酶K敏感。

2.3 β-巰基乙醇對重組Enterocin A抗菌活性的影響

表1 β-巰基乙醇對重組Enterocin A抗菌活性的影響Table 1 Effect ofβ-ME on anti-ListeriaLIN 3 activity of recombinant Enterocin A

由表1可知，在對照組中，含有LB或者LB＋β-ME的培養物中指示菌活菌數不變或者稍微升高，表明實驗濃度的β-巰基乙醇對指示菌不表現抑制作用。在實驗組中，含有重組Enterocin A的培養物中的活菌數明顯降低；而含有重組Enterocin A＋β-ME的培養物中的活菌數減少不明顯。該重組Enterocin A為N-端帶有融合標簽His-tag的融合多肽，N-端的34個融合氨基酸中沒有半胱氨酸，C-端Enterocin A部分含有的兩個半胱氨酸會形成兩個二硫鍵。二硫鍵為大多數細菌素所有，對抗菌活性起重要作用[11-12]。還原劑DTT、β-巰基乙醇等具有還原二硫鍵為半胱氨酸的能力。DTT處理的Pediocin PA-1和Enterocin A的抗菌活性明顯降低[12]。Ray等[13]的研究結果顯示還原劑DTT或者β-巰基乙醇處理的融合蛋白MBP-pediocin AcH的抗菌活性明顯降低。本研究結果表明β-巰基乙醇能夠還原重組Enterocin A中的二硫鍵，使其抗菌活性喪失。

2.4 溫度對重組Enterocin A抗菌活性的影響

圖3 溫度對重組Enterocin A抗菌活性的影響Fig.3 Effect of temperature on anti-ListeriaLIN 3 activity of recombinant Enterocin A

重組Enterocin A具有較高的熱穩定性。由圖3可知，在相同的溫度條件下，隨著處理時間的延長，重組細菌素的抗菌活性呈下降趨勢；相同的處理時間，隨著溫度的升高，其抗菌活性明顯降低。結果還表明，4℃貯存7d對重組Enterocin A的活性幾乎沒有影響。由于分子質量小、二硫鍵等因素，熱穩定性為一些細菌素的共同特點。細菌素Pediocin pK23-2經過121℃處理15min，其抗菌活性保持不變[14]。但是熱穩定性受pH值等其他因素的影響。細菌素Piscicolin 126樣品為pH2.0或pH3.0時，100℃處理120min不會影響其抗菌活性，而調整至pH4.0或pH5.0時，100℃處理15min即可導致50%的活性喪失[15]。

2.5 pH值對重組Enterocin A抗菌活性的影響

圖4為pH2.0～9.0時的重組Enterocin A的抗菌結果。表明pH2.0～9.0的PBS緩沖液均不表現抗李斯特菌活性。依據陽性判定標準[8]，該重組細菌素在pH2.0～8.0時均具有抗李斯特菌活性，在pH9.0時不表現抗菌活性。大多數細菌素通常在酸性環境中很穩定。Rodrí guez等[16]發現在pH4.0～6.0時，細菌素Pediocin PA-1于15℃貯存21d后仍非常穩定，但是調整溶液至pH7.0時，50%的細菌素活性喪失。

圖4 pH值對重組Enterocin A抗菌活性的影響Fig.4 Effect of pH on anti-ListeriaLIN 3 activity of recombinant Enterocin A

3 結 論

重組Enterocin A表現蛋白酶敏感性，胰蛋白酶、蛋白酶K均可使其抗李斯特菌活性喪失。β-巰基乙醇能夠還原重組細菌素中的二硫鍵，使其抗菌活性喪失，間接證明了二硫鍵為Enterocin A的內在活性因素。重組Enterocin A在pH6.5時具有較高的熱穩定性，60℃處理60min、80℃處理30min、100℃處理10min后仍保持抗菌活性。因此，在進行Enterocin A分子設計時，可以考慮在其N-端增加適合長度的氨基酸序列，使其既具有一定程度的蛋白酶耐受水平，又可以保持較高的熱穩定性。在選用的8種pH值條件下，重組Enterocin A在pH2.0～8.0時均表現抗菌活性，在pH9.0時不表現抗菌活性，這表明該重組細菌素在低pH值下具有穩定性。

[1] AYMERICH T, HOLO H, HAVARSTEIN L S, et al. Biochemical and genetic characterization of enterocin A fromEnterococcus faecium, a new antilisterial bacteriocin in the pediocin family of bacteriocins[J]. Appl Environ Microbiol, 1996, 62(5):1676-1682.

[2] AYMERICH T, GARRIGA M, YLLA J, et al. Application of enterocins as biopreservatives againstListeria innocuain meat products[J]. J Food Prot, 2000, 63(6):721-726.

[3] ENNAHAR S, DESCHAMPS N. Anti-Listeriaeffect of enterocin A,produced by cheese-isolatedEnterococcus faeciumEFM01, relative to other bacteriocins from lactic acid bacteria[J]. J Appl Microbiol, 2000,88(3):449-457.

[4] KLOCKE M, MUNDT K, IDLER F, et al. Heterologous expression of enterocin A, a bacteriocin fromEnterococcus faecium, fused to a cellulose-binding domain inEscherichia coliresults in a functionalprotein with inhibitory activity againstListeria[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 67(4):532-538.

[5] BEAULIEU L, TOLKATCHEV D, JETTE J F, et al. Production of active pediocin PA-1 inEscherichia coliusing a thioredoxin gene fusion expression approach:cloning, expression, purification, and characterization[J]. Can J Microbiol, 2007, 53(11):1246-1258.

[6] 趙愛珍, 韓文瑜, 徐興然, 等. Enterocin A在大腸桿菌中的表達及活性檢測[J]. 吉林農業大學學報, 2008, 30(1):89-92.

[7] SCHILLINGER U, LCKE F K. Antibacterial activity ofLactobacillus sakeisolated from meat[J]. Appl Environ Microbiol, 1989, 55(8):1901-1906.

[8] CINTAS L M, CASAUS P, HAVARSTEIN L S, et al. Biochemical and genetic characterization of enterocin P, a novel sec-dependent bacteriocin fromEnterococcus faeciumP13 with a broad antimicrobial spectrum[J].Appl Environ Microbiol, 1997, 63(11):4321-4330.

[9] 沈萍, 范秀容, 李廣武, 等. 微生物學實驗[M]. 北京:高等教育出版社, 1999:93-94.

[10] ENNAHAR S, AOUDE-WERNER D, ASSOBHEI O, et al. Antilisterial activity of enterocin 81, a bacteriocin produced byEnterococcus faeciumWHE 81 isolated from cheese[J]. J Appl Microbiol, 1998, 85(3):521-526.

[11] FIMLAND G, JOHNSEN L, AXELSSON L, et al. A C-terminal disulfide bridge in pediocin-like bacteriocins renders bacteriocin activity less temperature dependent and is a major determinant of the antimicrobial spectrum[J]. J Bacteriol, 2000, 182(9):2643-2648.

[12] EIJSINK V G, SKEIE M, MIDDELHOVEN P H, et al. Comparative studies of class Ⅱa bacteriocins of lactic acid bacteria[J]. Appl Environ Microbiol, 1998, 64:3275-3281.

[13] RAY B, SCHAMBER R, MILLER K W. The pediocin AcH precursor is biologically active[J]. Appl Environ Microbiol, 1999, 65(6):2281-2286.

[14] SHIN M S, HAN S K, RYU J S, et al. Isolation and partial characterization of a bacteriocin produced byPediococcus pentosaceusK23-2 isolated from kimchi[J]. J Appl Microbiol, 2008, 105(2):331-339.

[15] JACK R W, WAN J, GORDON J, et al. Characterization of the chemical and antimicrobial properties of piscicolin 126, a bacteriocin produced byCarnobacterium piscicolaJG126[J]. Appl Environ Microbiol, 1996, 62(8):2897-2903.

[16] RODRIGUEZ J M, MARTINEZ M I, KOK J. Pediocin PA-1, a widespectrum bacteriocin from lactic acid bacteria[J]. Crit Rev Food Sci Nutr, 2002, 42(2):91-121.

Effects of External Factors on Anti-ListeriaLIN 3 Activity of Recombinant Enterocin A

ZHAO Ai-zhen1，XU Xing-ran1，HAN Wen-yu2
(1. College of Pharmaceutical Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun 130062, China)

TS201.3

A

1002-6630(2010)17-0327-04

2010-06-04

趙愛珍(1972—)，女，副教授，博士，研究方向為乳酸菌細菌素的抗菌活性。E-mail：zaoaizhen@yahoo.com.cn