納米銀殺菌機理的研究進展

曲 鋒，許恒毅，熊勇華，賴衛華，魏 華*

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

納米銀殺菌機理的研究進展

曲 鋒，許恒毅，熊勇華，賴衛華，魏 華*

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

納米銀因其高效、廣譜及不易產生耐藥性等優點，已成為目前抗菌材料的研究熱點，但其殺菌機理尚有待于進一步研究。本文綜述了納米銀殺菌機理的最新進展，以期為納米銀抗菌材料的應用提供參考依據。

納米銀；殺菌機理；抗菌材料

Abstract：Nano-silver has become a hot topic in the field of antibacterial materials due to its high efficiency, wide spectrum and low drug-resistance to bacteria. However, the bactericidal mechanisms of nano-silver are still unclear. In this paper, current research progress in bactericidal mechanisms of nano-silver has been discussed, which will provide technical supports for further development and applications of nano-silver as an antimicrobial material.

Key words：nano-silver；bactericidal mechanism；antibacterial materials

銀的抗菌性能早在16世紀就被廣泛地應用于醫藥界，如用銀片覆蓋傷口預防潰爛，用銀絲織成紗布包裹皮膚創傷，嬰兒出生時滴上硝酸銀溶液可防止黏膜感染[1]。20世紀30年代，抗生素的發現一度使人們忽視了對銀抗菌性能的利用。然而，隨著抗生素等化學藥物的濫用，越來越多的微生物通過變異產生了耐藥性，使得一些由耐藥性細菌引起的疾病無法醫治。同時也使具備高效、廣譜及不易產生耐藥性等優點的銀系殺菌劑再次引起人們的重視。隨著納米技術的迅猛發展，將金屬銀加工成納米銀后，原子排列表現為介于固體和分子之間的“介態”，其比表面積極大，顯示明顯的表面效應、小尺寸效應和宏觀隧道效應，這種活性極強的納米銀微粒具備超強的抗菌能力[2]。如納米銀抗菌的有效濃度在納摩爾水平，低于銀離子的微摩爾水平近1000倍[3]。然而納米銀抗菌材料得以應用的同時，相關基礎研究則明顯滯后，納米銀的抗菌機理尚未認識清楚，這必將影響納米銀抗菌材料的進一步發展和更為廣泛的應用，本文將納米銀抗菌機理的研究進展做如下綜述。

1 米銀的制備及其應用

按照原理不同，納米銀顆粒的制備方法可以分為物理方法、化學方法和生物還原法3大類，如表1所示。

隨著科技的進步，未來的納米銀生產技術將向低成本、低消耗、低污染的方向發展。在物理、化學制備方法相對已較為成熟的情況下，具有獨特的技術和成本優勢的生物還原法將可能成為未來納米銀生產技術的突破口，尋找新的具有較強銀還原能力的菌種并優化其還原條件將是這種新技術的主要發展方向。

目前，納米銀已應用于水凈化領域。Jain等[14]將納米銀加入聚氨酯泡沫體中，含105cells/mL大腸桿菌的水以0.5L/min的流速通過該泡沫體后，全部細菌被殺死。Gong等[15]制備了Ag和Fe3O4的復合納米顆粒，它兼備了Fe3O4的超順磁性和Ag的強殺菌性，不僅有效殺死了細菌，而且完成處理后可利用磁場將其從水中清除，如此既避免了對環境造成污染，又可循環使用。

納米銀可通過尼綸、網布、水狀膠質、甲基纖維素、聚乙烯和聚丙烯等為載體，制成醫用敷料，適用于大部分的外傷治療。納米銀通過減少創傷的發炎和調節成纖維細胞因子，加快創傷的恢復速度并減小產生的疤痕[16]。將納米銀添加到PVA纖維和棉織物，制成的抗菌織物均表現出強殺菌效果。

最近一些研究表明，納米銀與多種抗生素和傳統中藥均有協同殺菌的作用，明顯增強了原藥物的殺菌效能，在藥物載體領域展現出良好的應用前景[17]。

表1 納米銀的制備方法、原理及優缺點Table 1 Preparation methods of nano-silver

2 納米銀對細菌的殺傷效果及影響因素

近年來，納米銀對細菌形態的損傷有了許多共性研究：經納米銀作用后，菌體細胞畸形且不完整；細胞外膜受到損傷，胞壁上出現小坑，胞膜上出現小孔；納米銀不僅作用于細胞外膜，而且進入了菌體細胞內部[18-24]。Shrivastava等[20]用透射電鏡仔細觀察了納米銀與細菌作用的過程：起初納米銀成簇地錨定在細胞壁上，這些位點可能是細胞壁上帶負電的功能團；隨后納米銀進入菌體，并錨定于細胞內的幾個位點，在細胞膜上形成齒孔；后期觀察到黑色碎片狀的沉淀物，Shrivastava等[20]認為該沉淀物是細菌內容物和納米銀結合的產物，這可能是一種降低局部納米銀濃度的防御機制，使得細菌延長了延滯生長期而沒有被全部殺死。謝小保等[24]也觀察到相似的過程：納米銀粒子先在細胞壁上產生小的孔洞，通過這些孔洞進入周質空間，導致細胞膜成分泄漏和破壞細胞膜，進而進入細胞內部，納米銀粒子使DNA濃縮呈緊張態，并與破損細菌的細胞質結合積聚，最后引起胞內物質流失。

納米銀破壞了菌體細胞膜的性質，使膜的通透性發生改變。經納米銀作用后，大量還原糖和蛋白質從菌體內泄漏到胞外[18]；Kim等[19]也有類似的發現，菌體內葡萄糖和海藻糖的含量明顯增加，釋放到胞外的量也明顯增加；正常情況下0.1%的SDS不能進入完整的菌體細胞，Lok等[25]發現細菌經納米銀作用后，SDS則可以進入菌體并發揮溶菌作用；細胞內的鉀幾乎全部流失，ATP消耗殆盡而且膜電位遭到破壞。1,6 -二苯基- 1,3,5-己三烯(DPH)通過與細胞膜磷脂雙分子層的酰基結合而嵌入膜內，Kim等[19]用流式細胞術發現菌體內DPH的量隨納米銀濃度的增加而減少，即納米銀破壞了細胞膜的磷脂雙分子層結構，并進一步影響了膜的通透性。Lok等[25]發現，大腸桿菌經納米銀處理后，菌體中5種包膜蛋白表達異常，并證明它們是以各自成熟蛋白前體的形式存在。作者認為，菌體膜電位的破壞和細胞內ATP的大量消耗造成這些包膜蛋白前體無法穿過胞膜，被加工成成熟蛋白。納米銀可以降低大腸桿菌呼吸鏈中脫氫酶的活性，并且納米銀濃度越高酶活性越低[18]。細菌內多種蛋白質已被證實會被磷酸化，蛋白質的磷酸化與細胞內的信號轉導有關。Shrivastava等[20]發現經納米銀處理后，菌體內有兩種蛋白質的磷酸酪氨酸被去磷酸化，據此認為納米銀通過影響菌體細胞的信號轉導，從而抑制細菌生長。有趣的是，該現象在大腸桿菌(G－)中被發現，在金黃色葡萄球菌(G+)中卻沒有出現。謝小保等[24]發現，納米銀使大腸桿菌DNA不再隨機分布在核區，而是在核區濃縮呈緊張態，且能夠增加大腸桿菌總DNA樣品的降解程度。

納米銀的殺菌效果受多方面的因素影響。納米銀顆粒自身的粒徑、形狀、濃度和表面修飾物等均能影響納米銀和菌體的接觸及侵入，造成的殺傷作用強弱也不同。不同類型的細菌在細胞壁結構上存在很大的差異：革蘭氏陰性菌的細胞壁最外層是一層脂多糖，往內是一層薄的肽聚糖(7～8nm)，脂多糖是由脂類和多糖共價連接的，整體缺乏強度和硬度；革蘭氏陽性菌的細胞壁主要由肽聚糖構成，線性的肽聚糖由小肽連接成相互交聯的網狀立體結構，比陰性菌的厚(20～80nm)且更致密，納米銀不但難以錨定在其上面，而且難以穿過細胞壁。諸多研究表明，納米銀對革蘭氏陰性菌的抑制或殺傷作用明顯強于革蘭氏陽性菌[20,26-27]。培養條件同樣可以影響納米銀的殺菌效果，培養基狀態、供氧和培養溫度都是重要的影響因素[22-23]。在液體培養基中的細菌被納米銀殺死后，細胞內容物與納米銀結合形成沉淀，降低了液體中局部的納米銀濃度，使得細菌在液體培養基中對納米銀的耐受能力明顯強于在固體培養基。氧氣供給和培養溫度能夠影響活性氧的產生和Ag+的釋放(表 2)。

表2 納米銀殺菌的影響因素Table 2 Affecting Factors of the bactericidal effect of nano-silver

3 納米銀的殺菌機理

3.1 損傷細菌DNA

DNA分子在松弛狀態下才能有效地進行復制，呈緊張狀態的DNA分子會失去復制的能力。DNA的任何損傷都會影響遺傳物質正常的復制及生物體的繁殖，納米銀通過損傷細菌DNA達到殺菌效果。如納米銀使大腸桿菌DNA不再隨機分布在細胞的核區，而是在核區濃縮呈緊張態，并增加菌體內總DNA的降解程度[24]，如圖1a所示。

3.2 中斷細胞信號轉導

細菌內多種蛋白質會被磷酸化，蛋白質的磷酸化與細胞內的信號轉導有關。Shrivastava等[20]發現，納米銀處理過的細菌中有兩種蛋白質的磷酸酪氨酸被去磷酸化，即納米銀影響了細胞正常的信號轉導，如圖1b所示。細胞裂解可能不是納米銀殺死細菌的唯一原因，納米銀有可能通過影響細胞的信號轉導而使細菌不能正常地存活。

3.3 活性氧自由基的氧化損傷

菌體表面微量的銀能起到催化活性中心的作用。Ag+激活空氣或水中的氧，產生羥自由基及活性氧離子，抑制或殺滅細菌[32]，如圖1c所示。Danilczuk等[33]在電子自旋共振光譜中發現了納米銀產生的自由基，Kim等[26]觀察到相同的結果并發現在培養基中加入抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸可以抵消納米銀的殺菌作用，即納米銀產生的自由基與它的抗菌性有關。Pal等[22]發現納米銀與細菌共培養初期的殺菌作用與其產生的活性氧有關，并證明殺菌的有效成分是羥自由基。由此推斷，納米銀可能通過產生自由基，進一步氧化菌體外膜使細菌死亡。

3.4 菌體內容物泄漏

電鏡觀察顯示，被納米銀作用后的菌體細胞膜遭到嚴重破壞，細胞壁上形成小坑，細胞膜上出現小孔，如圖1d所示。細胞膜的通透性也被破壞，大量的還原糖、蛋白質以及K+從菌體內泄漏，膜電位和ATP被消耗殆盡。一些學者認為經納米銀處理后，菌體細胞膜的通透性被改變，大量新陳代謝所必需的物質泄漏，導致了細菌的死亡[18-19,23]。

3.5 脫氫酶失活

納米銀粒徑極微小，可以進入細菌并與菌體中酶蛋白的巰基結合，使一些含巰基基團的酶失去活性，如圖1e所示。經納米銀處理后，大腸桿菌呼吸鏈中脫氫酶的活性明顯降低，并且納米銀的濃度越高酶活性越低[18]。另據Matsumura等[34]報道，抑制呼吸酶活性可能與活性氧的產生有關。脫氫酶失活后，細菌既不能獲取正常生命活動所需的能量，又受到活性氧的氧化殺滅作用。

圖1 納米銀殺菌機制示意圖Fig.1 Bactericidal mechanisms of nano-silver

4 待解決的問題

諸多研究已經證實：納米銀先黏附在細菌外膜上，再穿過外膜對細菌造成損傷[18-24]。但是，納米銀與細菌外膜結合的機理仍不清楚。一般認為帶正電荷的納米銀通過靜電吸附作用黏附到帶負電荷的細菌外膜[24-35]，而Sondi等[23]觀察到帶負電荷的納米銀也具有強殺菌性能。由此可知靜電吸附不是納米銀黏附在細菌外膜上的主要原因，探究納米銀與細菌外膜的何種成分發生了作用，對進一步探討納米銀的殺菌機理有重要的意義。此外，目前尚未見報道納米銀在細菌內部是以何種形式存在并對細菌造成殺傷的。細菌的大部分生化反應在納米級尺度發生，因此納米銀顆粒不僅可以游離出Ag+殺傷細菌，而且有機會直接介入細菌的新陳代謝。探討納米銀在細菌內部的存在形式也是闡明其殺菌機理的前提條件。

5 結 論

綜上所述，納米銀通過如下機制殺菌：損傷細菌DNA、活性氧自由基的氧化損傷、脫氫酶失活、菌體內容物泄漏和中斷細胞信號轉導。納米銀的殺菌效果受自身性質、細菌性質和培養條件等多方面因素的影響。目前，對納米銀殺菌機理的研究主要集中在用電鏡觀察菌體損傷以及測定納米銀殺菌效能等方面，今后的發展方向必定為從分子水平和代謝水平對其做出分析，從而為深入闡明這一機理奠定基礎。雖然納米銀的殺菌機理至今仍未徹底闡明，但隨著分析方法的不斷進步，該殺菌機理將逐漸清晰。納米銀殺菌機理的闡明，有利于人們更好地將納米銀應用到食品、醫藥、環境保護等多個領域，造福于人類。

[1] 袁鵬, 何宏平. 銀系無機抗菌劑的研究進展[J]. 化工礦物與加工,2002, 31(10):5-9.

[2] 劉偉, 張子德, 王琦, 等. 納米銀對常見食品污染菌的抑制作用研究[J]. 食品研究與開發, 2006, 27(5):135-137.

[3] DIBROV P, DZIOBA J, GOSINK K K, et al. Chemiosmotic mechanism of antimicrobial activity of Ag+inVibrio cholerae[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2002, 46(8):2668-2670.

[4] XU J, YIN J S, MA E. Nanocrystalline Ag formed by low-temperature high-energy mechanical attrition[J]. Nanostructured Materials, 1997, 8(1):91-100.

[5] AHMED M, LEONG W K. Colloidal silver nanoparticles stabilized by a water-soluble triosmium cluster[J]. Journal of Organometallic Chemistry,2006, 691(5):1055-1060.

[6] FITZ-GERALD J, PENNYCOOK S, GAO H, et al. Synthesis and properties of nanofunctionalized particulate materials[J]. Nanostructured Materials, 1999, 12(5/8):1167-1171.

[7] HUSSAIN I, BRUST M, PAPWORTH A J, et al. Preparation of acrylate-stabilized gold and silver hydrosols and gold-polymer composite films[J]. Langmuir, 2003, 19(11):4831-4835.

[8] 姚素薇, 劉恒權, 張衛國, 等. 在線性殼聚糖膜內原位還原制備銀納米粒子及銀單晶體[J]. 物理化學學報, 2003, 19(5):464-468.

[9] 廖學紅, 紅李鑫. 電化學制備納米銀[J]. 黃岡師范學院學報, 2001,21(5):58-59.

[10] 廖學紅, 朱俊杰, 趙小寧, 等. 納米銀的電化學合成[J]. 高等學校化學學報, 2000, 21(12):1837-1839.

[11] KLAUS T, JOERGER R, OLSSON E, et al. Silver-based crystalline nanoparticles, microbially fabricated[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1999, 96(24):13611-13614.

[12] 林種玉, 劉月英. 貴金屬離子非酶法生物還原機理初探[J]. 物理化學學報, 2001, 17(5):477-480.

[13] 傅錦坤, 劉月英. 細菌吸附還原貴金屬離子特性及表征[J]. 高等學校化學學報, 1999, 20(9):1452-1454.

[14] JAIN P, PRADEEP T. Potential of silver nanoparticle-coated polyurethane foam as an antibacterial water filter[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2005, 90(1):59-63.

[15] GONG Ping, LI Huimin, HE Xiaoxiao, et al. Preparation and antibacterial activity of Fe3O4@Ag nanoparticles[J]. Nanotechnology, 2007, 18:285604.

[16] TIAN J, WONG K, HO C M, et al. Topical delivery of silver nanoparticles promotes wound healing[J]. Chem Med Chem, 2007, 2(1):129-137.

[17] FAYAZ A M, BALAJI K, GIRILAL M, et al. Biogenic synthesis of silver nanoparticles and their synergistic effect with antibiotics:a study against gram-positive and gram-negative bacteria[J]. Nanomedicine, 2010,6(1):103-9.

[18] LI Wenru, XIE Xiaobao, SHI Qingshan, et al. Antibacterial activity and mechanism of silver nanoparticles onEscherichia coli[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 85(4):1115-1122.

[19] KIM K J, SUNG W S, SUH B K, et al. Antifungal activity and mode of action of silver nano-particles onCandida albicans[J]. Biometals, 2009,22(2):235-242.

[20] SHRIVASTAVA S, BERA T, ROY A, et al. Characterization of enhanced antibacterial effects of novel silver nanoparticles[J].Nanotechnology, 2007, 18(22):225103-225112.

[21] PAL S, TAK Y K, SONG J M. Does the antibacterial activity of silver nanoparticles depend on the shape of the nanoparticle? A study of the gram-negative bacteriumEscherichia coli[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(6):1712-1720.

[22] PAL S, TAK Y K, JOARDAR J, et al. Nanocrystalline silver supported on activated carbon matrix from hydrosol:antibacterial mechanism under prolonged incubation conditions[J]. Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 2009, 9(3):2092-2103.

[23] SONDI I, SALOPEK-SONDI B. Silver nanoparticles as antimicrobial agent:a case study onE. colias a model for Gram-negative bacteria[J].Journal of Colloid and Interface Science, 2004, 275(1):177-182.

[24] 謝小保, 李文茹, 曾海燕, 等. 納米銀對大腸桿菌的抗菌作用及其機制[J]. 材料工程, 2008(10):106-109.

[25] LOK C N, HO C M, CHEN Rong, et al. Proteomic analysis of the mode of antibacterial action of silver nanoparticles[J]. Journal of Proteome Research, 2006, 5(4):916-924.

[26] KIM J S, KUK E, YU K N, et al. Antimicrobial effects of silver nanoparticles[J]. Nanomedicine:Nanotechnology, Biology, and Medicine,2007, 3(1):95-101.

[27] AMIN R M, MOHAMED M B, RAMADAN M A, et al. Rapid and sensitive microplate assay for screening the effect of silver and gold nanoparticles on bacteria[J]. Nanomedicine, 2009, 4(6):637-643.

[28] PANACEK A, KVITEK L, PRUCEK R, et al. Silver colloid nanoparticles:synthesis, characterization, and their antibacterial activity[J]. Journal of Physical Chemistry B, 2006, 110(33):16248-16253.

[29] MORONES J R, ELECHIGUERRA J L, CAMACHO A, et al. The bactericidal effect of silver nanoparticles[J]. Nanotechnology, 2005, 16:2346-2353.

[30] KVITEK L, PANACEK A, SOUKUPOVA J, et al. Effect of surfactants and polymers on stability and antibacterial activity of silver nanoparticles(NPs)[J]. Journal of Physical Chemistry C, 2008, 112 (15):5825-5834.

[31] DROR-EHRE A, MAMANE H, BELENKOVA T, et al. Silver nanoparticle-E. colicolloidal interaction in water and effect onE. colisurvival[J]. Journal of Colloid and Interface Science, 2009, 339(2):521-526.

[32] INOUE Y, HOSHINO M, TAKAHASHI H, et al. Bactericidal activity of Ag-zeolite mediated by reactive oxygen species under aerated conditions[J]. Journal of Inorganic Biochemistry, 2002, 92(1):37-42.

[33] DANILCZUK M, LUND A, SADLO J, et al. Conduction electron spin resonance of small silver particles[J]. Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2006, 63(1):189-191.

[34] MATSUMURA Y, YOSHIKATA K, KUNISAKI S, et al. Mode of bactericidal action of silver zeolite and its comparison with that of silver nitrate[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(7):4278-4281.

[35] STOIMENOV P, KLINGER R, MARCHIN G, et al. Metal oxide nanoparticles as bactericidal agents[J]. Langmuir, 2002, 18(17):6679-6686.

Research Progress in Bactericidal Mechanisms of Nano-silver

QU Feng，XU Heng-yi，XIONG Yong-hua，LAI Wei-hua，WEI Hua*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

TS207.4

A

1002-6630(2010)17-0420-05

2010-05-10

江西省優秀博士學位論文培育計劃基金項目(YBP08A03)

曲鋒(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為納米材料毒性。E-mail：qufeng7@yahoo.com.cn

*通信作者：魏華(1966—)，男，研究員，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：hua_wei114@yahoo.com.cn