谷氨酰胺轉氨酶改性菜籽蛋白凝膠特性的研究

袁 建，鞠興榮，何 榮，王立峰,，朱小虎

(1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省糧油品質控制及深加工技術實驗室，江蘇 南京 210003；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

谷氨酰胺轉氨酶改性菜籽蛋白凝膠特性的研究

袁 建1，鞠興榮1，何 榮2，王立峰1,2，朱小虎1

(1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省糧油品質控制及深加工技術實驗室，江蘇 南京 210003；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

為改善菜籽蛋白質的凝膠特性，采用谷氨酰胺轉氨酶(TG)以單因素試驗和正交試驗研究影響菜籽分離蛋白(RPI)凝膠特性的主要因素——TG質量濃度、pH值、反應溫度和反應時間。結果表明：反應溫度和 pH 值對菜籽分離蛋白凝膠性的影響顯著，同時得到谷氨酰胺轉氨酶改性菜籽蛋白凝膠特性的最佳工藝條件，RPI質量濃度1.5g/10mL、加酶量50U/g RPI、pH9.0、反應溫度40℃、反應時間20min。

菜籽分離蛋白；谷氨酰胺轉氨酶；凝膠性

Abstract：Enzymatic modification with transglutaminase (TG) was used to improve gel property of protein. The effects of TG amount, pH, reaction temperature and reaction time were explored on the basis of single factor experiments and orthogonal experiments. Results indicated that pH and reaction temperature exhibited a significant effect on gel strength on of rapeseed protein isolate (RPI). The optimal conditions for modifying gel property of RPI with TG were protein concentration of 1.5 g/10 mL,TG addition amount of 50 U/g, pH 9.0, reaction temperature of 40 ℃ and reaction time of 20 min.

Key words：rapeseed protein isolate (RPI)；transglutaminase (TG)；gel property

菜籽蛋白主要是由12S 球蛋白和1.7S或2S 蛋白質組成，是一種優質蛋白質，其氨基酸組成符合FAO/WHO推薦模式值，PER值高于其他植物蛋白，甚至高于酪蛋白[1]。菜籽蛋白除了具有較好的營養特性外，其吸水性、吸油性、起泡性和乳化性都優于大豆蛋白，但是不具有形成凝膠的能力[2-3]，菜籽蛋白作為添加劑改善肉或香腸質構特性的應用受到了限制。

目前，對于植物蛋白凝膠特性的研究，主要集中在對大豆分離蛋白凝膠性的研究上，通過物理、化學、酶和基因工程的方法，改變大豆蛋白的分子結構，從而改變其凝膠特性[4-6]，而對菜籽蛋白凝膠特性的研究甚少，國內還未見相關報道。本實驗采用谷氨酰胺轉氨酶對菜籽蛋白限制性水解，通過單因素試驗和正交試驗，探討谷氨酰胺轉氨酶改性對菜籽蛋白凝膠特性的影響，為進一步研究菜籽蛋白的凝膠性提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜籽分離蛋白[通過堿溶酸沉法制得[7]，由凱氏定氮法測得粗蛋白為82.55%(占干基質量)]；谷氨酰胺轉氨酶(100U/g，TG) 江蘇省泰興市一鳴精細化工有限公司；實驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TDL-5-A離心機 上海安亭科學儀器廠；pHS-3C精密數顯pH計 上海精密科學儀器廠；85-1磁力攪拌機 金壇市醫療儀器廠；HH-4數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；質構分析儀 英國Stable Micro System公司。

1.3 方法

1.3.1 菜籽分離蛋白凝膠的制備

參照Tang等的方法[8]，并略有修改。取一定量菜籽蛋白，溶于0.1mol/L NaCl溶液中，配制成不同濃度、不同pH值的菜籽蛋白溶液；取一定量谷氨酰胺轉氨酶(TG)，溶于0.1mol/L NaCl溶液中，配制成不同濃度的酶溶液，調節pH值與菜籽蛋白溶液一致，將上述兩溶液用磁力攪拌器攪拌2h，使其充分溶解。各取5mL已溶解的菜籽蛋白溶液和酶溶液于10mL小燒杯得到不同酶與底物濃度比的蛋白-酶混合溶液。

將裝有蛋白-酶混合溶液小燒杯置于不同溫度的水浴中，反應一段時間，取出置于95℃的水浴中保溫15min進行滅酶，取出，冰水浴冷卻后于4℃的冰箱放置24h，取出陳化30min，測試，研究不同反應時間、溫度、pH值、加酶量對菜籽蛋白凝膠性的影響。

1.3.2 菜籽蛋白凝膠特性的測定

用質構儀(TPA)測定菜籽蛋白的凝膠特性，選用直徑為10mm的圓柱狀平頭探頭(p/0.5)[9]。測前速度2mm/s；測試速度1mm/s；測后速度2mm/s；穿刺距離10mm；時間5s。做3次平行試驗，取平均值得到凝膠質構參數，選取膠凝性作為評價指標。

膠凝性(g)：將半固體食品咀嚼至可吞咽時所做的功，與硬度和內聚性有關。按照質構儀說明書定義。

膠凝性=硬度×內聚性

式中：硬度(g)為第一次壓縮(第一次咀嚼)過程中的峰值力；內聚性為表示測試樣品經過第一次壓縮變形后所表現出來的對第二次壓縮的相對抵抗能力，在曲線上表現為兩次壓縮所做正功之比(面積2/面積1)。

1.3.3 單因素試驗設計

1.3.3.1 加酶量對菜籽蛋白凝膠性的影響

調蛋白-酶混合溶液pH6.0，水浴溫度50℃，保溫30min，加酶量(U/g RPI)分別為0、20、40、80、100。

1.3.3.2 pH值對菜籽蛋白凝膠性的影響

調蛋白-酶混合溶液pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，水浴溫度50℃，保溫30min，加酶量50U/g RPI。

1.3.3.3 反應溫度對菜籽蛋白凝膠性的影響

調蛋白-酶混合溶液pH9.0，保溫30min，加酶量50U/g RPI。水浴溫度(℃)分別為 20、30、40、50、60、70、80。

1.3.3.4 反應時間對菜籽蛋白凝膠性的影響

調蛋白-酶混合溶液pH9.0，水浴溫度50℃，加酶量50U/g RPI。反應時間(min)分別為10、20、30、40、50、60。

1.3.5 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以加酶量、pH值、反應時間、反應溫度為影響因素，設計L9(34)正交試驗，優化谷氨酰胺轉氨酶改性菜籽蛋白的凝膠特性的工藝條件，結果見表1(其中，RPI質量濃度為1.5g/10mL)。

表1 工藝條件優化正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal array design

1.4 數據分析

每個實驗重復3次，結果采用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 加酶量對菜籽蛋白凝膠性的影響

圖1 加酶量對菜籽蛋白凝膠性的影響Fig.1 Effect of TG amount on the gel property of rapeseed protein

由圖1可以看出，隨著TG加酶量的增加，RPI的凝膠強度不斷升高，超過60U/g時，RPI的凝膠強度開始下降，并隨著加酶量的升高，該值下降較為顯著。本試驗中，加酶量達到60U/g RPI時，RPI的凝膠強度達到最大值，說明維系蛋白質凝膠網絡的穩定所需的共價鍵的數目只有一定的飽和性，過多的酶量對蛋白的水解程度加深，反而不利于凝膠的空間網絡，導致凝膠破裂強度在高加酶量時下降[10]；同時也可以看出，在不加TG的情況下，菜籽蛋白幾乎不形成凝膠，說明TG的改性是菜籽蛋白形成凝膠的重要因素，而TG也常被用于蛋白質的改性[11-12]。由曲線圖可以看出，40～60U/g RPI的加酶量變化不大，因此，以TG加酶量50U/g RPI進行以下試驗。

2.1.2 pH值對菜籽蛋白凝膠性的影響

圖2 pH值對菜籽蛋白凝膠性的影響Fig.2 Effect of pH on the gel property of rapeseed protein

圖2顯示了pH值對RPI凝膠性的影響。可以看出，在pH值較低情況下，隨著pH值的升高，凝膠強度有所波動，在pH9.0時凝膠強度達到最高點，超過9.0時，隨著pH值的升高，RPI的凝膠強度不斷下降。這是因為體系pH值的改變一方面影響酶活性和穩定性，另一方面影響CPI的溶解性，影響蛋白質相互作用過程中的疏水作用與靜電作用之間的平衡[5]。另外，pH7.0處有一個低點，是因為pH7.0是RPI的一個等電點，此pH值下其溶解性較低[13]。因此，最適 pH值為9.0，此條件下，RPI的凝膠性最好，可以達到21.5g。

2.1.3 反應溫度對菜籽蛋白凝性膠的影響

圖3 反應溫度對菜籽分離蛋白凝性膠的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on the gel property of rapeseed protein

由圖3所示，在TG加酶量50U/g RPI的條件下，RPI的凝膠強度隨反應溫度的升高，呈先升高后降低趨勢，溫度在50℃時RPI的凝膠強度最大。這是因為，一方面溫度影響酶的反應速率，溫度升高，反映速度加快，另一方面也影響酶的活性，高溫會使酶失活，酶對蛋白的改性能力減弱[14]。因此，反應最適溫度為50℃。

2.1.4 反應時間對菜籽蛋白凝膠性的影響

由圖4可以看出，在反應時間較短的情況下，隨著時間的延長，RPI的凝膠強度有所升高，反應20min后RPI凝膠強度開始下降，最后趨于一個穩定值。長時間的水解反應使RPI的凝膠強度有所減弱，但在0～60min內，RPI凝膠強度變化不大，極差為3.15g。實驗得出最適反應時間為20min。

圖4 反應時間對菜籽蛋白凝膠性的影響Fig.4 Effect of reaction time on the gel property of rapeseed protein

2.2 工藝優化正交試驗

表2 正交試驗結果和極差分析Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results

由表2可以看出，定義菜籽蛋白凝膠特性影響因素的主次順序為C＞B＞A＞D，即反應溫度對菜籽蛋白凝膠特性的影響較大，pH值、加酶量次之，反應時間影響最小。根據試驗結果分析，谷氨酰胺轉氨酶改性菜籽蛋白凝膠特性的最佳條件為A2B2C1D2，即加酶量50U/g RPI、pH9.0、反應溫度40℃、處理時間20min。在此條件下進行驗證實驗，菜籽蛋白的凝膠性可以達到23.65g，凝膠特性較好。

以影響因素D(反應時間)為誤差項對上述試驗結果進行方差分析，結果如表3所示，可以看出因素C(反應溫度)對菜籽蛋白凝膠性的影響極顯著(F=117.34＞F0.01(2,2)=99.0，P＜0.01)，B(pH值)對菜籽蛋白凝膠性的影響顯著(F=22.92＞F0.05(2,2)=19.0，P＜0.05)，也就是說，在實際操作過程中，只有嚴格控制該酶反應的溫度和p H值，才能達到預期的目的。

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis for the gel property of rapeseed protein with various TG reaction conditions

3 結 論

通過單因素試驗和正交試驗，研究了谷氨酰胺轉氨酶改性菜籽蛋白凝膠性的影響因素。結果表明：反應溫度對菜籽蛋白凝膠特性的影響較大，pH值、加酶量次之，反應時間的影響最小，其中反應溫度和pH值的影響較為顯著，實際操作中應該嚴格控制這兩個條件。得出谷氨酰胺轉氨酶改性菜籽蛋白凝膠性的最佳工藝條件為：RPI質量濃度1.5g/10mL、加酶量50U/g RPI、pH9.0、反應溫度40℃、反應時間20min，該條件下菜籽蛋白的凝膠性可以達到23.65g，凝膠性較好。

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Gel Property of Transglutaminase-modified Rapeseed Protein

YUAN Jian1，JU Xing-rong1，HE Rong2，WANG Li-feng1,2，ZHU Xiao-hu1
(1. Jiangsu Provincial Laboratory of Quality Control and Further Professing of Food and Oil, College of Food Science and Engineering,Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210003, China；2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

TQ931

A

1002-6630(2010)18-0010-04

2009-11-19

國家“863”計劃項目(2007AA10Z331)；國家農業成果轉化資金項目(2009C10045)

袁建(1965—)，男，教授，本科，研究方向為食品科學。E-mail：yuanjian@njue.edu.cn