不同沉淀方法分離甘薯β-淀粉酶的研究

賈彥杰，梁新紅，朱文學(xué)，孫俊良,*，郭祖鋒

(1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471003；2.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

不同沉淀方法分離甘薯β-淀粉酶的研究

賈彥杰1，梁新紅2，朱文學(xué)1，孫俊良2,*，郭祖鋒2

(1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471003；2.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

研究鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法分離甘薯β-淀粉酶的工藝條件，分析鹽析飽和度、有機(jī)溶劑體積比和溶液pH值對回收率及提純倍數(shù)的影響。結(jié)果表明：硫酸銨飽和度在70%時(shí)，酶活性回收率達(dá)到78.1%，提純1.56倍；乙醇體積比4:1時(shí)，酶活性回收率達(dá)到76.8%，提純2.61倍；當(dāng)溶液pH4.5～5.0、丙酮體積比3:1時(shí)，酶活性回收率可達(dá)到90.66%，提純了3.29倍，此條件下β-淀粉酶分離效果最佳。

甘薯；β-淀粉酶；沉淀；分離；鹽析

Abstract：Salting out and organic solvent precipitation methods were solely used to precipitateβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate. The effects of saturation degree for salting out, volume ratio for organic solvents and pH on the recovery rate and purity ofβ-amylase were investigated. Results indicated that the specific activity ofβ-amylase reached up to 78.1% and its purity exhibited a 1.56-fold enhancement when the saturation degree of ammonium sulfate was 70%; the specific activity ofβ-amylase reached up to 76.8% and its purity exhibited a 2.61-fold enhancement when 4-fold volume of ethanol was added to the supernatant of sweet potato homogenate; and the highest separation efficiency was achieved and the specific activity ofβ-amylase reached up to 90.66% with a 3.29-fold enhancement in purity when pH varied from 4.5 to 5.0 and 3-fold volume of acetone was used instead of 4-fold volume of ethanol.

Key words：sweet potato；β-amylase；precipitation；separation；salting out

β-淀粉酶是一種水解酶，作用于淀粉時(shí)，分解淀粉分子中的α-1,4葡萄糖苷鍵，從還原性末端開始，按照麥芽糖單位依次水解，同時(shí)發(fā)生沃爾登轉(zhuǎn)化，使產(chǎn)物由α型變?yōu)棣滦望溠刻牵虼朔Q為β-淀粉酶[1-2]。β-淀粉酶在食品加工、釀造、糧食加工以及醫(yī)藥等行業(yè)具有重要應(yīng)用價(jià)值[3]。β-淀粉酶存在于植物與微生物中，而我國目前利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)的β-淀粉酶主要有耐熱性差，成本較高等缺點(diǎn)。而從植物中提取的β-淀粉酶具有酶活力高、耐熱性較好、作用pH值范圍廣等特點(diǎn)。植物β-淀粉酶主要存在于甘薯、麥麩、大豆、大麥芽以及蘿卜中。我國甘薯、麥麩產(chǎn)量很高，價(jià)格低廉，可以從中提取β-淀粉酶[4]。甘薯β-淀粉酶酶活力高、淀粉易回收，因此甘薯是制備β-淀粉酶最為理想的原料[5]。

鹽析沉淀法是許多酶初純階段經(jīng)常采用的方法，而有機(jī)溶劑沉淀無需專門方法去除沉淀劑，此法簡便、安全[6]。目前，關(guān)于乙醇沉淀分離β-淀粉酶的研究已有報(bào)道[7]，而有關(guān)鹽析及其他有機(jī)溶劑沉淀分離β-淀粉酶相比較的工藝研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過硫酸銨鹽析、乙醇及丙酮沉淀方法分離甘薯β-淀粉酶，以期找到較為合適的分離方法，為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘薯 市售；考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白、3,5-二硝基水楊酸等(均為分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

RC5C型冷凍離心機(jī) 美國Sovall公司；pHSJ-3F型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)、FA1204B型分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；7200型分光光度計(jì) 尤尼克(上海)儀器有限公司；SQ2002多功能食品加工機(jī) 上海帥佳電子科技有限公司；MD34透析袋(8000～14000kD) 美國聯(lián)合碳化物公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液提取

取新鮮甘薯50g，洗凈后切成1cm3左右小塊，加入100mL的去離子水，于勻漿機(jī)中勻漿(26000r/min，1min)，4層紗布過濾，濾液冷凍離心(4℃，4000r/min，15min)，取上清液4℃冰箱中保藏備用。

1.3.2 硫酸銨鹽析甘薯β-淀粉酶方法

取7支試管，每支加入粗酶液5mL，分別加入硫酸銨至飽和度為20%、40%、60%、70%、80%、90%、100%，邊加邊攪拌，混勻后，用磷酸-檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)溶液pH值至5.0，4℃冰箱中放置4h，8000r/min冷凍離心15min后，收集沉淀。將沉淀用磷酸緩沖液溶解，選用截留分子量為1萬D的透析袋透析除鹽24h。測透析后甘薯β-淀粉酶酶活力及蛋白含量，計(jì)算出回收率及提純倍數(shù)。

1.3.3 乙醇、丙酮分級(jí)沉淀甘薯β-淀粉酶方法

取一定量粗酶提取液，緩慢加入預(yù)冷乙醇或丙酮分別至不同體積比(乙醇:粗酶液，V/V，下同)，用磷酸-檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)溶液pH值至5.0，4℃冰箱中放置4h，8000r/min冷凍離心15min后，收集沉淀，將沉淀用磷酸緩沖液溶解。測沉淀分離后甘薯β-淀粉酶酶活力及蛋白含量，計(jì)算出回收率及提純倍數(shù)。

1.3.4 甘薯β-淀粉酶酶活回收率計(jì)算

1.3.5 甘薯β-淀粉酶提純倍數(shù)計(jì)算

蛋白質(zhì)測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同飽和度硫酸銨對甘薯β-淀粉酶分離效果影響

植物β-淀粉酶提取過程中有許多成分的物質(zhì)溶出，除雜與提純是確定酶活性穩(wěn)定的要素[10]。選用不同飽和度硫酸銨鹽析甘薯粗提取液，根據(jù)1.3.2節(jié)所述方法，考察不同飽和度硫酸銨對甘薯β-淀粉酶回收率及提純倍數(shù)影響，結(jié)果見圖1、2。

圖1 不同飽和度硫酸銨對β-淀粉酶回收率的影響Fig. 1 Effect of (NH4)2SO4with various saturation degrees on the recovery rate ofβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate

圖2 不同飽和度硫酸銨對β-淀粉酶提純倍數(shù)影響Fig.2 Effect of (NH4)2SO4with various saturation degrees on the purification fold ofβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate

圖1表明，不同飽和度硫酸銨對β-淀粉酶回收率影響較大。硫酸銨飽和度在20%～40%范圍內(nèi)，回收率變化不大。隨著硫酸銨飽和度增加，酶活回收率呈增大趨勢，在70%時(shí)β-淀粉酶活性回收率最高達(dá)到(78.05±0.8)%，飽和度在大于80%時(shí)，酶活回收率迅速降低。分析圖2可知，硫酸銨飽和度在70%時(shí)，提純倍數(shù)達(dá)到最大，提純(1.56±0.031)倍。經(jīng)顯著性方差分析，硫酸銨飽和度在60%～80%范圍內(nèi)，P＜0.05水平上回收率及提純倍數(shù)都有顯著性差異，因此，硫酸銨鹽析β-淀粉酶最佳飽和度為70%。

2.2 有機(jī)溶劑沉淀β-淀粉酶實(shí)驗(yàn)

2.2.1 乙醇不同添加量對甘薯β-淀粉酶回收率及提純倍數(shù)的影響

圖3 不同體積比乙醇對甘薯β-淀粉酶回收率的影響Fig.3 Effect of ethanol amount on the recovery rate ofβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate

由圖3可知，在乙醇體積比為0.2:1～4:1條件下，酶活性回收率隨著乙醇體積比的增加而增大，在4:1處達(dá)到最大為(76.80±0.03)%。這與文獻(xiàn)報(bào)道的乙醇體積比不同，可能是因?yàn)楦适聿煌贩N所致[11]。經(jīng)顯著性方差分析，乙醇體積比在3:1～4:1范圍內(nèi)，在P＜0.05水平上沒有顯著性差異。圖4結(jié)果表明，在體積比0.2:1～5:1范圍內(nèi)，提純了(0.21±0.014)～(2.62±0.16)倍，在體積比4:1時(shí)，提純倍數(shù)達(dá)到最大，達(dá)到2.62倍。經(jīng)顯著性方差分析，在體積比3:1～5:1范圍內(nèi)，在P＜0.05水平上有顯著性差異。因此，乙醇沉淀β-淀粉酶最佳體積比為4:1。

圖4 不同體積比乙醇對甘薯β-淀粉酶提純倍數(shù)的影響Fig.4 Effect of ethanol amount on the purification fold ofβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate

2.2.2 不同丙酮添加量對甘薯β-淀粉酶回收率及提純倍數(shù)的影響

圖5 不同體積比丙酮對甘薯β-淀粉酶回收率的影響Fig.5 Effect of acetone amount on the recovery rate ofβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate

圖6 不同體積比丙酮對甘薯β-淀粉酶提純倍數(shù)的影響Fig.6 Effect of acetone amount on the purification fold ofβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate

由圖5可知，不同的丙酮與粗酶液體積比對β-淀粉酶回收率影響較大。體積比為0.2:1～3:1范圍時(shí)，酶活回收率逐漸升高，在3:1處達(dá)到最大，回收率為(88.05±0.05)%，然后隨著丙酮用量的增加，回收率逐漸降低。圖6分析可知，丙酮與粗酶液體積比為3:1時(shí)，提純倍數(shù)最高，提純(2.64±0.09)倍。經(jīng)顯著性方差分析，在丙酮體積比2:1～4:1范圍內(nèi)，P＜0.05水平上回收率及提純倍數(shù)都有顯著性差異。因此，丙酮沉淀β-淀粉酶最佳體積比為3:1。

由以上硫酸銨、乙醇、丙酮沉淀甘薯β-淀粉酶對比實(shí)驗(yàn)可知，丙酮沉淀效果最佳，在丙酮與粗酶液體積比3:1時(shí)，回收率及提純倍數(shù)達(dá)到最高，分別為(88.05±0.05)%、2.64±0.09。

2.2.3 丙酮沉淀β-淀粉酶最佳pH值的確定

由于酶蛋白在其等電點(diǎn)處靜電荷為零，溶解度最低，容易沉淀析出，故在確定丙酮沉淀甘薯β-淀粉酶體積比3:1為最佳分離條件后，按上述工藝加入丙酮，用磷酸緩沖液分別調(diào)節(jié)溶液pH值至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，測定甘薯β-淀粉酶酶活及蛋白含量。計(jì)算酶活回收率及提純倍數(shù)，結(jié)果如圖7、8所示。

圖7 不同pH值對甘薯β-淀粉酶回收率的影響Fig.7 Effect of pH of acetone solution on the recovery rate ofβamylase from the supernatant of sweet potato homogenate

圖8 不同pH值對甘薯β-淀粉酶提純倍數(shù)的影響Fig.8 Effect of pH of acetone solution on the purification fold ofβamylase from the supernatant of sweet potato homogenate

由圖7分析可知，沉淀β-淀粉酶時(shí)pH值對酶回收率影響較明顯。在pH4.0～4.5范圍內(nèi)，酶活性回收率迅速增大，在pH4.5時(shí)達(dá)到最大值(90.66±0.02)%，隨著pH值繼續(xù)增大，回收率又逐漸降低。圖8表明，pH值對β-淀粉酶提純倍數(shù)影響較大，變化范圍為(2.27±0.12)～(3.29±0.17)，在pH5.0處達(dá)到最大，提純(3.29±0.17)倍。經(jīng)顯著性方差分析，在pH4.5～5.5范圍內(nèi)，P＜0.05水平上酶活回收率沒有顯著性差異，在pH4.0～6.0范圍內(nèi)提純倍數(shù)有顯著性差異。綜合分析，pH5.0為丙酮沉淀β-淀粉酶最佳pH值。

3 結(jié)論與討論

3.1 通過對硫酸銨鹽析和有機(jī)溶劑沉淀甘薯β-淀粉酶進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)，得出利用丙酮沉淀分離β-淀粉酶為最佳的分離條件，當(dāng)丙酮體積比3:1、pH4.5～5.0時(shí)回收率最高可達(dá)90.66%，提純3.29倍，這與李瑩等[7]的乙醇沉淀甘薯β-淀粉酶結(jié)果相比較，提純倍數(shù)有較大的提高，由此可知，用丙酮沉淀甘薯β-淀粉酶更為合理。

3.2 隨著pH值的變化，酶活性回收率及提純倍數(shù)變化幅度較大，說明在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下，酶液易失活[12-13]。在pH4.5處，酶液表現(xiàn)出較高活性。

3.3 通過最佳pH的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在pH5.0處提純倍數(shù)達(dá)到最高，由于在等電點(diǎn)處蛋白質(zhì)易沉淀，可知甘薯β-淀粉酶的等電點(diǎn)應(yīng)為5.0左右。這與朱婉華等[14]測得的大豆β-淀粉酶等電點(diǎn)基本一致。

3.4 本實(shí)驗(yàn)通過對β-淀粉酶分離方法的比較實(shí)驗(yàn)，得出了較為合適的分離方法，為β-淀粉酶的進(jìn)一步純化提供了重要依據(jù)。

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Separation ofβ-amylase from Sweet Potato by Different Precipitation Methods

JIA Yan-jie1，LIANG Xin-hong2，ZHU Wen-xue1，SUN Jun-liang2,*，GUO Zu-feng2
(1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China；2. College of Food, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China)

Q814.1

A

1002-6630(2010)18-0022-04

2010-05-20

河南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(102102210192)；河南科技學(xué)院博士基金項(xiàng)目(09001)

賈彥杰(1985—)，男，碩士研究生，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：henankeyuan@126.com

*通信作者：孫俊良(1964—)，男，教授，博士，主要從事食品發(fā)酵微生物與酶制劑研究。E-mail：sjl@hist.edu.cn