酶解花生蛋白制備功能性短肽條件優化研究

范遠景，孟凡莉，易苗苗，高海成，陳 偉，張華傳，陳蘇霞

(1.合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009；2.安徽凱利糧油食品有限公司，安徽 合肥 231600)

酶解花生蛋白制備功能性短肽條件優化研究

范遠景1，孟凡莉1，易苗苗1，高海成1，陳 偉2，張華傳2，陳蘇霞2

(1.合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009；2.安徽凱利糧油食品有限公司，安徽 合肥 231600)

為優化Alcalase蛋白酶酶解花生蛋白制備功能性多肽的工藝條件，采用響應面分析法，以水解度、短肽得率為響應值，研究溫度、pH值、底物質量分數、酶底比對制備功能性多肽工藝的影響。綜合考慮成本和工藝要求等問題，最終確定酶解花生蛋白制備功能性多肽的工藝條件為溫度55℃、pH8.4、底物質量分數4.31%、酶底比3.39%、時間4h。該條件下水解度(DH)及三氯乙酸可溶性氮溶解指數(TCA-NSI)分別為23.40%和74.88%，與理論值的相對誤差在0.5%以內，優化工藝穩定，DH及TSA-NSI較高，實驗結果與模型預測值相符。

花生蛋白；功能性多肽；酶解；響應面分析法

Abstract：In the present study, alkaline protease hydrolysis was used for the preparation of functional polypeptides from peanut protein. In order to optimize the enzymatic hydrolysis of peanut protein, the effects of temperature, pH, substrate concentration, enzyme amount on degree of hydrolysis (DH) and trichloroacetic acid nitrogen solubility index (TCA-NSI) were explored using response surface methodology. The optimal conditions for achieving both high DH and TCA-NSI were found to be hydrolysis temperature of 55 ℃, pH 8.4, substrate concentration of 4.31%, protease amount of 3.39% and hydrolysis time of 4 h. Under these optimal conditions, a DH of 23.40 and a TCA-NSI of 74.88% were obtained. The experimental values were consistent with the predicted ones with a relative error within 0.5%, indicating that these optimized hydrolysis conditions are reliable.

Key words：peanut protein；functional polypeptide；enzymatic hydrolysis；response surface methodology

花生蛋白中氨基酸分布廣泛，含有人體必需的8種氮基酸，屬于完全蛋白。在人體必需的8種氨基酸中，除蛋氨酸含量較低外，賴氨酸、色氨酸、蘇氨酸含量均接近聯合國糧農組織所規定的標準，而其他4種氨基酸含量也接近或超過了此標準，其構成比例適中，而且賴氨酸含量比大米、小麥、玉米粉高3～8倍，其有效利用率達98.94%，而大豆中的賴氨酸有效利用率僅為78%。花生中富含精氨酸、谷氨酸和天門冬氨酸，精氨酸具有調節血糖、有效保護肝臟、增強人體免疫力和抗疲勞等功效，后兩種氨基酸則對腦細胞發育和增強記憶力有良好的促進作用[1-3]。

生物活性短肽具有免疫調節、激素調節、降血壓、降血脂、抗疲勞、抗氧化等生理調節功能，是當前國際醫藥界、食品界最熱門的研究課題和極具發展前景的功能因子[4-7]。雖然國內外對植物蛋白活性肽的研究達到了一定水平，相關產品已應用于醫療保健，但主要為大豆活性肽產品，而對花生短肽的研究才剛剛起步，相關產品開發甚少，無法滿足食品需求[8-10]。在我國花生長期以來大都用作榨油和飼料，存在很大的資源浪費[11-12]。因此開發花生活性肽可以改善這類局面。

本實驗針對短肽類產品低水解度、低得率的問題，進行深入研究，以冷榨花生蛋白粉為原料，利用酶法水解工藝制備花生短肽，通過考察溫度、pH值、底物質量分數、酶底比對堿性蛋白酶酶解花生蛋白的影響，利用二次回歸正交旋轉組合設計方法確定最佳酶解工藝條件，從而制備出高得率和高水解度的功能短肽。為花生功能性短肽產業提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生蛋白粉(自制)；堿性蛋白酶(食品級) 南寧龐博生物工程有限公司；三氯乙酸(分析純) 廣東汕頭市西隴化工廠；牛血清蛋白(分析純) Solarbio公司。

1.2 儀器與設備

KA-1000離心機 上海安亭科學儀器廠；R-210旋轉蒸發儀 上海申勝生物技術有限公司；752紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；LGL-12冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司；精密pH計 上海虹益儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 制備花生短肽的工藝路線

花生分離蛋白(過100目篩)→用蒸餾水配制成8g/100mL→堿溶酸沉→酶解→離心→水解液→滅酶→水解蛋白液→分離→水解蛋白短肽

堿溶酸沉條件：pH8.50、溫度60℃、提取時間2h；酶解條件：在55℃、pH8.0、加入3%(酶與花生蛋白的質量比)堿性蛋白酶，酶解5h；離心條件：4000r/min、離心10min；滅酶條件：90℃加熱15min。

1.3.2 測定方法

1.3.2.1 水解度的測定

水解度(DH)采用pH-stat法[13-14]測定。

式中：DH為水解度/%；VNaOH為堿液體積/mL；CNaOH為堿液的濃度/(mol/L)；α為氨基的解離度，α=[10(pH-pK)]/[1+10(pH-pK)]，其中pK值為a-氨基酸的平均pK值，取7.0；pH為反應起始的pH值；mp為底物中蛋白質總質量/g；htot為底物中蛋白質中肽鍵總數/(mmol/g)，對花生蛋白而言，htot=7.13(根據花生蛋白的氨基酸組成計算得到)。

1.3.2.2 短肽得率測定

短肽得率采用三氯乙酸-可溶性氮法(TCA-NSI)[15]測定。可溶性氮溶解指數(TCA-NSI)按式(2)計算。

TCA-NSI=TCA上清液總氮量/蛋白溶液總氮量×100% (2)

1.3.3 響應曲面(response surface methodology，RSM)分析

中心組合設計(central composite-orthogonal design，CCD)是研究多因素問題強有力的工具，在食品工業中應用最為廣泛[16]。本實驗在完整的單因素試驗結果基礎上，采用SAS8.1設計了四因素五水平的CCD。

2 結果與分析

2.1 酶解條件的單因素試驗

因各種蛋白酶的底物特異性及作用位點的差異，不同蛋白酶作用于花生蛋白而得到的酶解產物的功能也有所不同。因此在本課題的前期研究工作中[17]，在采用堿性蛋白酶、風味酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶各自的最適溫度、pH值及底物質量分數([S])、酶底比([E]/[S])、反應時間的條件下酶解花生分離蛋白4h，并根據5種不同蛋白酶的水解度(DH)和三氯乙酸可溶性氮溶解指數(TCA-NSI)篩選出最合適的酶種為堿性蛋白酶(Alcalase)。

在酶種確定的前提下，影響蛋白質水解物的DH和TCA-NSI的主要因素有底物質量分數、酶底比、反應溫度、pH值及時間等[7]，因而單因素試驗分別討論了上述因素對酶解效果的影響。

2.1.1 不同溫度對DH和TCA-NSI的影響

堿性蛋白酶在50～65℃范圍內水解花生蛋白時的DH和TCA-NSI的變化如圖1所示。

圖1 溫度對DH和TCA-NSI的影響Fig.1 Effect of hydrolysis temperature on DH and TCA-NSI

圖1結果顯示：在50～60℃過程中體系的DH和TCA-NSI逐漸上升，在60℃左右時DH和TCA-NSI最大，60℃以后體系的DH和TCA-NSI逐漸下降。因此堿性蛋白酶水解花生蛋白的最適溫度在55～60℃。

2.1.2 不同pH值對水解DH和TCA-NSI的影響

堿性蛋白酶在pH6.0、7.0、8.0、9.0、10.0條件下水解花生蛋白時的DH和TCA-NSI的變化如圖2所示。

圖2 pH值對DH和TCA-NSI的影響Fig.2 Effect of pH on DH and TCA-NSI

由圖2可知，pH值小于7.0時體系的DH及TCANSI都很小，說明堿性蛋白酶更適合于堿性環境。隨著pH值增大，體系的DH及TCA-NSI都逐漸上升，到pH9.0時，二者都達到最大值，pH9.0以后體系的DH及TCANSI都有下降的趨勢。可見堿性蛋白酶的最適pH值在8.0～9.0之間。考慮到pH值從8.0上升到9.0短肽得率并沒有多大提高，而且在實際生產中pH值的升高會增加脫鹽的成本，因此確定pH值為8.0。

2.1.3 底物質量分數對DH和TCA-NSI的影響

堿性蛋白酶在底物質量分數4%～12%范圍內水解花生蛋白時的DH和TCA-NSI的變化如圖3所示。

圖3 底物質量分數對DH和TCA-NSI的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on DH and TCA-NSI

由圖3可知，底物質量分數對DH和TCA-NSI的影響不完全一致。底物質量分數在4%～12%范圍內，體系的DH是呈下降趨勢，存在明顯的底物抑制現象。當底物質量分數從4%增加到8%時，DH下降幅度較大，而后幅度逐漸變小。另一方面，底物質量分數對TCANSI的影響曲線呈鐘形，底物質量分數4%～8%之間，TCA-NSI隨著底物質量分數增大而增大，8%時達到最大，之后隨著底物質量分數增大而逐漸變小。綜合DH和TCA-NSI兩個指標考慮，堿性蛋白酶水解花生蛋白的最適底物質量分數在6%左右。

2.1.4 酶底比對DH和TCA-NSI的影響

堿性蛋白酶在酶底比0.5%～8%范圍內水解花生蛋白時的DH和TCA-NSI的變化如圖4所示。

圖4 酶底比對DH和TCA-NSI的影響Fig.4 Effect of enzyme-to-substrate ratio on DH and TCA-NSI

如圖4可以看出，酶底比在0.5%～8%范圍內，DH和TCA-NSI的變化呈現相似的趨勢，在酶底比0.5%～3%之間，DH和TCA-NSI隨著酶底比的增加而快速增加，酶底比4%以后DH和TCA-NSI的增幅并不明顯。因此當酶底比達到4%時，再進一步增加酶底比對提高肽的得率已沒有明顯效果，此時蛋白酶對底物的作用位點已大大減少，因而水解度隨著酶底比的加大基本不再變化。由此確定堿性蛋白酶最適酶底比在3%～4%之間。

2.1.5 反應時間對DH和TCA-NSI的影響

堿性蛋白酶水解花生蛋白0～5h內DH和TCA-NSI的變化如圖5所示。

圖5 反應時間對DH和TCA-NSI的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on DH and TCA-NSI

由圖5可知，堿性蛋白酶水解花生蛋白分為兩個階段，前120min水解反應比較迅速，DH和TCA-NSI呈快速上升趨勢，水解120min時DH和TCA-NSI分別達到17.80%和54.94%。240min之后水解反應速度減緩，DH和TCA-NSI的上升幅度減小。因此，確定堿性蛋白酶最適水解時間在240min左右。

2.2 二次回歸正交旋轉組合試驗

采用二次回歸正交旋轉組合試驗，在堿性蛋白酶單因素試驗確定酶解4h的基礎上進行組合設計。以水解溫度、pH值、底物質量分數和酶底比4個因素共同作用，以DH和TCA-NSI為響應值，按照表1的試驗設計進行四因素五水平共31次試驗點的響應面分析，運用SAS8.1統計軟件對數據進行分析處理，建立DH和TCANSI與各因素關系的數學模型，并通過對模型的分析以獲得最佳的水解工藝條件。

表1 中心組合試驗因素水平編碼表Table 1 Factors and levels in the central composite design

2.2.1 DH回歸方程的建立與檢驗

根據表2結果計算各項回歸系數，建立DH(Y1)與4因素的數學回歸模型為：

表2 回歸設計試驗結果處理表Table 2 Central composite design arrangement and experimental results

由表3方差分析可知，回歸方程的失擬性檢驗F1=3.959241＜F0.05(10,6)=4.06不顯著，可以認為所選用的二次回歸模型是合適的。回歸方程的顯著性檢驗F2=29.44＞F0.01(14,16)=3.45極顯著，說明回歸模型的預測值與實際值非常吻合，模型成立。對回歸系數顯著性檢驗，在α=0.10顯著水平剔除不顯著項，得到優化后的方程為：

表3 回歸方程各項的方差分析表Table 3 Variance analysis for each term of the established regression equation with DH as a function

由均方分析可見，影響DH的4因素的主次順序是p H值、酶底比、溫度、底物質量分數。

溫度和pH值的交互作用對DH影響的響應面分析見圖6。

圖6 溫度和pH值交互作用對DH影響的響應面和等高線分析Fig.6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of temperature and pH on DH

由圖6可知，開始時隨著溫度(X1)和pH值(X2)的升高，DH(Y1)逐漸增加；但當溫度和pH值升高到一定程度時，DH開始下降。即溫度和pH值過高或過低時，DH均不能達到最大值。

2.2.2 TCA-NSI回歸方程的建立與檢驗

表4 回歸方程各項的方差分析表Table 4 Variance analysis for each term of the established regression equation with TCA-NSI as a function

由表4方差分析可知，回歸方程的失擬性檢F1=2.661336＜F0.05(10,6)=4.06不顯著，可以認為所選用的二次回歸模型是合適的。回歸方程的顯著性檢驗F2=31.176＞F0.01(14,16)=3.45極顯著，說明回歸模型的預測值與實際值非常吻合，模型成立。對回歸系數顯著性檢驗，在α=0.10顯著水平剔除不顯著項，得到優化后的方程為：

由均方分析可見，影響TCA-NSI的4因素的主次順序是p H值、酶底比、溫度、底物質量分數。

溫度和pH值的交互作用對TCA-NSI的響應面分析見圖7。

由圖7可知，隨著溫度(X1)的升高，TCA-NSI(Y2)逐漸增加；在堿性條件下，酶解溫度的升高，也會加劇花生蛋白的變性，使TCA-NSI向著增大的趨勢發展。隨著pH值(X2)的增大，TCA-NSI先增大后減小。

pH值和底物質量分數的交互作用對TCA-NSI的響應面分析見圖8。

圖7 溫度和pH值交互作用對TCA-NSI影響的響應面和等高線分析Fig.7 Response surface and contour plots showing the interactive effects of temperature and pH on TCA-NSI

圖8 pH值和底物質量分數對CA-NSI影響的響應面和等高線分析Fig.8 Response surface and contour plots showing the interactive effects of pH and substrate concentration on TCA-NSI

由圖8可知，隨著pH值(X2)的增加，TCA-NSI(Y2)先增加后減小；隨著底物質量分數(X3)的增加，TCANSI(Y2)先增加后減小，pH值和底物質量分數之間存在交互作用。

2.3 酶解工藝參數的優化組合及結果驗證

通過SAS 8.1響應面分析模擬得出DH最高得率23.40%的優化組合X1=－0.17199、X2=－0.65463、X3=0.04476、X4=0.99302，即溫度為54.14℃、pH8.3、底物質量分數為6.09%、酶底比為3.99%；通過SAS 8.1響應面分析模擬得出TCA-NSI最高為74.88%的優化組合為X1=0.02822、X2=－0.63356、X3=－0.84484、X4=0.39098，即溫度為55.14℃、pH8.4、底物質量分數為4.31%、酶底比為3.39%；考慮底物質量分數對DH影響不顯著，對TCA-NSI影響極顯著，綜合各因素的影響大小，確定酶解最佳工藝參數為溫度55℃、pH8.4、底物質量分數為4.31%、酶底3.39%、時間4h。根據最優化組合的預測值進行驗證，結果DH=(23.40±0.5)%、TCA-NSI=(74.88±0.5)%(n=3)。預測值與實際值基本一致，說明預測條件與實際情況較符合。而通過正交試驗設計所得優化參數：pH8.0，反應溫度為60℃、底物質量分數4%、酶底比4%、水解時間240min。在此條件下DH和TCA-NSI分別為22.39%和58.15%。這與中心組合設計所得結果相差甚遠，由此可得中心組合對因素和水平的組合具有廣泛應用。

3 結 論

本實驗利用堿性蛋白酶酶解花生蛋白制備多肽，通過完整的單因素試驗和響應曲面分析得到以下結論：

3.1 以水解度(DH)為響應值，其回歸模型為：

3.2 以TCA-NSI為響應值，其回歸模型為：

3.3 通過二次回歸正交旋轉組合設計確定制備花生功能性多肽的最佳酶解條件為溫度55℃、pH8.4、底物質量分數4.31%、酶底比3.39%、時間4h。該條件下水解度(DH)及三氯乙酸可溶性氮溶解指數(TCA-NSI)分別為23.40%和74.88%。

[1] 段淑芬. 花生蛋白資源的開發與利用[J]. 花生科技, 1985(3):43-45.

[2] 萬書波, 封海勝, 王秀貞. 花生營養成分綜合評價與產業化發展戰略研究[J]. 花生學報, 2004, 33(2):1-6.

[3] 周雪松, 趙謀明. 我國花生食品產業現狀與發展趨勢[J]. 食品與發酵工業, 2004, 30(6):84-89.

[4] 王樹華, 王樹祥, 王均. 抓緊發展生物活性肽[J]. 化工管理, 2004(5):25-27.

[5] 吳建平. 日本生理活性肽的市場動態[J]. 食品工業, 1998(3):8-9.

[6] 吳建平. 生物活性肽的研究進展[J]. 食品與機械, 1998(1):6-8.

[7] BYUN H G, KIM S K. Purification and characterization of angiotensinⅠconverting enzyme (ACE) inhibitory peptides from Alaska pollack(Theragra chalcogramma) skin[J]. Process Biochemistry, 2001, 36:1155-1162.

[8] 周雪松. 花生蛋白改性研究[J]. 食品加工, 2005(3):42-45.

[9] 周瑞寶. 花生加工技術[M]. 北京:化學工業出版社, 2003.

[10] 曹凱光. 花生資源的綜合開發利用[J]. 江西食品工業, 2002(1):15-17.

[11] 傅鐵信. 中國花生行業分析[J]. 糧油加工與食品機械, 2004(12):10-11; 15.

[12] 林坤耀. 我國花生蛋白的研究概況[J]. 廣東農業科學, 2004(增刊1):15-16.

[13] ADLER-NISSEN J. Enzymic hydrolysis of food proteins[M]. London:Elsevier Applied Science Publishers, 1986.

[14] 袁斌, 呂桂善, 劉小玲. 蛋白質水解度的簡易測定方法[J]. 廣西農業生物科學, 2002(3):113-115.

[15] CHAVAN V D, MCKENZIE D B, SHAHIDI F. Functional properties of protein isolates from beach pea (Lathyrus maritimusL.)[J]. Food Chem,2001, 74:177-187.

[16] 慕運動. 響應面方法及其在食品工業中的應用[J]. 鄭州工程學院學報, 200l, 22(3):91-94.

[17] 孟凡莉. 花生肽的酶法制備、分離純化及其抗氧化活性研究[D]. 合肥:合肥工業大學, 2010.

Optimization of Enzymatic Hydrolysis Conditions for Preparing Functional Polypeptide from Peanut Protein

FAN Yuan-jing1，MENG Fan-li1，YI Miao-miao1，GAO Hai-cheng1，CHEN Wei2，ZHANG Hua-chuan2，CHEN Su-xia2
(1. School of Biotechnology and Food Engineeing, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China；2. Anhui Kaili Cereals, Oils and Foodstuffs Co. Ltd., Hefei 231600, China)

TQ464.7

A

1002-6630(2010)18-0031-06

2009-11-25

安徽省2008科技攻關計劃重大科技專項(08010302091)；合肥市科技項目(2008-1025)

范遠景(1958—)，男，教授，博士，研究方向為食品科學。E-mail：swf89105@mail.hf.ah.cn