PCR方法快速檢測食品中幽門螺桿菌

史艷宇，劉金華，安 偉，李媛媛，王 瑩，朱 穎，王 偉，劉俊會

(1.吉林省產品質量監督檢驗院，吉林 長春 130022；2.吉林出入境檢驗檢疫局，吉林 長春 130062)

PCR方法快速檢測食品中幽門螺桿菌

史艷宇1，劉金華2，安 偉1，李媛媛1，王 瑩1，朱 穎1，王 偉1，劉俊會1

(1.吉林省產品質量監督檢驗院，吉林 長春 130022；2.吉林出入境檢驗檢疫局，吉林 長春 130062)

目的：建立一種快速、特異、靈敏的幽門螺桿菌檢測方法。方法：以尿素酶基因序列為靶位點設計引物，進行PCR擴增，建立幽門螺桿菌PCR檢測方法。以食品中常見致病菌作參考菌株作特異性檢測，分別對幽門螺桿菌菌懸液及鮮牛奶中幽門螺桿菌菌懸液進行梯度稀釋，提取DNA后做靈敏度檢測。結果：PCR方法能夠有效對幽門螺桿菌進行快速檢測，具有較強的特異性，靈敏度較高(8CFU/mL)。結論：該方法特異性強，靈敏度高，可以快速、準確檢測食品中污染的幽門螺桿菌。

幽門螺桿菌；尿素酶基因；P CR；檢測

Abstract：The contamination ofHelicobacter pyloriis considered as a serious problem to impair public health in both developed and developing countries. In order to establish a fast, specific and sensitive method to detect the contamination ofHelicobacter pyloriin food, PCR method was used to detect the DNA ofHelicobacter pyloribased on urease gene. Results indicated that this method was highly specific toHelicobacter pyloriand sensitive and presented a limit detection of 8 CFU/mL forHelicobacter pylori. Therefore, this method is applicable to clinical practice, environment control and inspection of exported food.

Key words：Helicobacter pylori；urease gene；PCR；detection

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是一種彎曲、螺旋狀革蘭氏陰性桿菌。經流行病學調查證實，罹患胃病的人群中，有超過50%的人感染幽門螺桿菌，幽門螺桿菌感染與慢性萎縮性胃炎、十二指腸潰瘍、胃黏膜相關性淋巴組織淋巴瘤和胃腺癌的發生有關[1-2]，WHO已經將幽門螺桿菌列為第一類致癌因子[3]。由于幽門螺桿菌與人類常見病密切相關且在人群中感染率高，因而受到重視。

幽門螺桿菌對體外生長條件要求苛刻，培養困難，傳統培養方式對于快速準確進行檢測與鑒定有一定難度[4]。因此如何快速檢驗這些食品中的幽門螺桿菌，保證人民食品安全，是一個重要課題。除了傳統培養方法，現在國內外幽門螺桿菌其他檢測方法主要有：直接鏡檢法、染色法、尿素酶法、免疫學法、核酸雜交技術、聚合酶鏈反應(PCR)、基因蕊片、毛細管電泳技術等[5]。這些方法在臨床樣品檢測方面應用較多，但在食品中幽門螺桿菌檢測方面應用較少，目前國內尚無食品中幽門螺桿菌快速有效檢測方法及相關標準。

近年來大量研究證明，食品在人類感染幽門螺桿菌中起到重要作用，是幽門螺桿菌傳播的途徑之一[6-7]。因此研究食品中幽門螺桿菌的快速、簡便、準確的檢測鑒定方法尤其必要。

1 材料與方法

1.1 材料與菌株

鮮牛奶和雞肉 市售。

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，ATCC 43504)；大腸桿菌(Escherichia coli，ATCC 25922)；金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC 13565)；單增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，ATCC 15313)；沙門氏菌(Salmonella typhimurium，AS1.1194)；空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni，ATCC 33291)。

1.2 試劑與培養基

細菌基因組小量提取試劑盒(AxyPrepTMMultisource Genomic DNA Miniprep Kit) 美國Axygen公司；TaqHS DNA聚合酶、dNTP(各2.5mmol/L)、10×buffer緩沖液、6 ×Loading buffer、100bp DNA Ladder Marker等寶生物工程(大連)有限公司；PCR引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

腦心浸液肉湯培養基(BHIB，根據產品說明書配制)青島高科園海博生物技術有限公司；胰蛋白大豆瓊脂 美國Becton Dickinson公司；ICPBIO無菌小牛血清 新西蘭ICPBIO生物技術(集團)有限公司；無菌脫纖維馬血煙臺開發區品格林實驗室配套設備有限公司。

1.3 儀器與設備

Microfuge 22R Centrifuge高速冷凍離心機 美國Beckman公司；M20食物研磨器 德國IKA公司；Tgradient-96 PCR擴增儀 德國Biometra公司；Bio Specmini DNA/RNA/蛋白分析儀 日本島津公司；SAVANT PS500A電泳儀 美國Savant公司；EDAS290凝膠成像系統 美國Kodak公司；生化恒溫培養箱 德國賓得公司；微量移液器(0.1～1000μL) 法國Gilson公司；M308277恒溫水浴鍋 北京中西遠大科技有限公司；厭氧罐 日本三洋公司。

1.4 方法

1.4.1 幽門螺桿菌的稀釋與計數

取幽門螺桿菌凍干粉接種于BHIB增菌肉湯培養基，按照5%培養基體積量加入無菌小牛血清，于微需氧條件下37℃振蕩培養3d，在600nm波長處測定培養液吸光度。在吸光度達到1.0時，取1mL菌液涂胰蛋白大豆瓊脂平板進行計數(單位CFU/mL)，另取1mL菌液用作模板DNA的提取。

1.4.2 DNA的提取

取幽門螺桿菌培養物，按細菌基因組小量提取試劑盒說明書的方法進行DNA提取，但相關步驟要略作修改：延長裂解酶作用時間至20min。用DNA分析儀檢測其純度及濃度。

1.4.3 幽門螺桿菌引物設計

根據幽門螺桿菌尿素酶基因，在Genebank中檢索到1個基因序列(Accession M60398)。根據基因序列設計引物。在Genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)中，經Blast軟件對相似序列搜索后，篩選出一套最優與常見致病菌無交叉反應的引物。

Forword primer：5＇-AAGCTTTTAGGGGTG TTAGGGGTTT-3＇；

Reverse primer：5＇-CAAGCCATCGCCGG TTTTAGC-3＇，擴增片段249bp。

1.4.4 反應體系和反應條件

反應體系(共20μL)：10×Ex TaqBuffer(Mg2+plus)2μL，dNTPs Mixture (各2.5mmol/L) 2μL，上下游引物(20μmol/L)各1μL，Ex Taq(5U/μL) 1μL，模板DNA 2μL，ddH2O 11μL。

反應條件：階段1：95℃預變性2min；階段2：94℃變性1min，61℃退火20s，72℃延伸30s，35個循環；階段3：72℃延伸5min。

1.4.5 特異性實驗

分別用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、沙門氏菌、空腸彎曲菌等食品中常見致病菌進行特異性實驗。

1.4.6 靈敏度實驗

取1mL在1.4.1節計數過的幽門螺桿菌菌懸液，梯度稀釋后，分別提取DNA進行PCR檢測，確定檢測方法的靈敏度。

1.4.7 PCR方法用于實際食品樣品檢測

取鮮牛奶、雞肉(制成勻漿)樣品9mL與3mL幽門螺桿菌菌懸液充分混勻、離心，取沉淀提取DNA，進行PCR檢測。

1.4.8 PCR方法測定牛奶中幽門螺桿菌的靈敏度

取1mL計數過的幽門螺桿菌菌懸液與9mL牛奶樣品混合均勻，用牛奶分別進行10倍梯度稀釋。分別提取DNA，按上述反應條件進行PCR擴增，檢測食品基質對檢測方法靈敏度的影響。

2 結果與分析

2.1 尿素酶基因特異性驗證

在優化好的PCR反應體系和反應條件下，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、沙門氏菌、空腸彎曲菌的DNA為特異性實驗對照進行PCR檢測。電泳結果顯示，僅有幽門螺桿菌被擴增出條帶，而其他對照以及陰性對照均未擴增出條帶，具體結果見圖1。

圖1 幽門螺桿菌PCR特異性檢測結果Fig.1 Specificity of PCR detection ofHelicobacter pylor

2.2 靈敏度實驗

分別取各濃度幽門螺桿菌菌懸液，提取DNA進行PCR檢測，結果顯示利用尿素基因設計的引物對幽門螺桿菌的檢測敏感性可達到8CFU/mL，具體結果見圖2。

圖2 PCR敏感性檢測結果Fig.2 Sensitivity of PCR detection ofHelicobacter pylor

2.3 應用尿素酶基因檢測人工污染樣品中的幽門螺桿菌

應用尿素酶基因的特異引物對人工污染的鮮牛奶及雞肉進行PCR檢測，結果表明該方法能有效檢測出試樣中的幽門螺桿菌，具體結果見圖3。

圖3 檢測人工污染樣品中的幽門螺桿菌Fig.3 PCR detection ofHelicobacter pyloriin artificially contaminated samples

2.4 PCR方法測定鮮牛奶中幽門螺桿菌的靈敏度

取1mL計數過的幽門螺桿菌菌懸液與牛奶混合，梯度稀釋后分別提取DNA進行PCR檢測，結果顯示牛奶中幽門螺桿菌的檢測敏感度達到8CFU/mL，具體結果見圖4。

圖4 牛奶基質對PCR靈敏度檢測結果的影響Fig.4 Sensitivity of PCR detection forHelicobacter pylori-contained milk

3 結 論

本研究根據尿素酶基因設計特異性引物，成功建立食品中幽門螺桿菌的PCR檢測方法，填補了食品中幽門螺桿菌檢測方法及標準的空白。與以往相關研究方法比較，本研究方法具有快速、靈敏(靈敏度為8CFU/mL)、特異的特點。

[2] GUILLERMO I P, ROTHENBACHER D, BRENNER H. Epidemiology ofHelicobacter pyloriinfection[J]. Helicobacter, 2004, 9(2):1-6.

[3] BROWN L M.Helicobacter pylori:Epidemiology and routes of transmission[J]. Epidemiologic Reviews, 2000, 22(2):283-297.

[4] STEVENSON T H, LUCIA L M, ACUFF G R, et al. Grow ofHelicobacter pyloriin various liquid and plating media[J]. Letters in Applied Microbiology, 2000, 30(3):192-196.

[5] 李會強. 幽門螺旋桿菌實驗室診斷方法[J]. 中國慢性病預防與控制,2007, 15(2):187-190.

[6] GOMES B C, de MARTINIS E C P. The significant ofHelicobacter pyloriin water, food and environmental samples[J]. Food Control,2004, 15(3):397-403.

[7] FAN Xuegong, CHUA A, LI Tiegang, et al. Survival ofHelicobacter pyloriin milk and tap water[J]. Journal of Gastroenterology and Hepatology, 1998, 13(11):1096-1098.

Rapid PCR Detection ofHelicobacter pyloriin Food

SHI Yan-yu1，LIU Jin-hua2，AN Wei1，LI Yuan-yuan1，WANG Ying1，ZHU Ying1，WANG Wei1，LIU Jun-hui1
(1. Jilin Product Quality Supervision Inspection, Changchun 130022, China；2. Jilin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Changchun 130062, China)

Q939.1

A

1002-6630(2010)18-0255-03

2009-12-15

國家質量監督檢驗檢疫總局項目(2008QK059)

史艷宇(1977—)，女，高級工程師，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：shiyanyu219@163.com