中藥復方抗纖抑癌方和復方鱉甲軟肝片不同采血時間點藥物血清對Hep G2肝癌細胞增殖活性的影響

趙志敏，葉永安，楊先照，甘大楠，馬賀成，劉 方

(北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700)

0 引言

藥物血清因其方法學上的特點而使其在中醫(yī)學的研究中具有一定的優(yōu)勢［1］，也是中醫(yī)藥研究的重要手段。目前研究采用人來源的藥物血清日益增多，但是中藥多是復方，成分復雜多樣，多數(shù)中藥人體藥物代謝動力學不明，在不同時間點收集到的藥物血清作用效果可能會存在差異。本實驗我們選取葉永安教授臨床治療原發(fā)性肝癌較為有效的方劑復方抗纖抑癌方與中成藥復方鱉甲軟肝片制備人來源藥物血清，采用MTT法檢測不同抽血時間點、不同藥物的藥物血清對HepG2細胞增殖是否存在差異。

1 材料與方法

1.1 材料

人藥物血清取自3名健康志愿者，男性，年齡25歲～32歲之間，了解實驗目的并簽訂知情同意書，服藥前后各檢查血尿便常規(guī)、肝腎功、心電圖1次。

藥品:復方抗纖抑癌方:柴胡、黃芪、山藥等。飲片購自東直門醫(yī)院中藥房。復方鱉甲軟肝片由內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司生產(chǎn)，批準文號國藥準字 Z19991011，0.5g/片，批號20090322;

細胞:HepG2人肝癌細胞，購自武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心，常規(guī)復蘇、傳代后，在37℃5%CO2條件下細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)待用。

試劑:噻唑蘭(Sigma)購自北京優(yōu)博奧生物技術(shù)有限公司;二甲基亞砜(DMSO)購自sigma公司;MEM培養(yǎng)基干粉購自GIBCO公司;胎牛血清購自HyClone公司;胰蛋白酶購自Solarbio。實驗于北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)內(nèi)科學重點實驗室完成。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清制備 志愿者在服藥前空腹抽血1次，制備服藥前空白對照血清;在服用復方抗纖抑癌方3d后，第4天晨起空腹服藥后0.5h、1h、2h各抽血1次，制備復方抗纖抑癌方藥物血清;在服用復方鱉甲軟肝片3d后，第4天晨起空腹服藥后1h、2h 抽血，每次8ml，室溫靜置 30min，離心分離血清(4000r/min，20min)，56℃ 30min 滅活、分裝，于 －70℃保存?zhèn)溆谩７?種藥物之間間隔1周作為洗脫期。

1.2.2 分組 我們先將1h、2h采集的復方抗纖抑癌方和復方鱉甲軟肝片藥物血清用無血清MEM培養(yǎng)基配成20%、10%、5%共3個濃度，同時設無血清MEM組為對照組，觀察不同抽血時間點藥物血清作用下的HepG2肝癌細胞生長狀態(tài)。之后追加0.5h采集的復方抗纖抑癌方藥物血清與其自身1h、2h采血點比較，藥物血清用無血清MEM培養(yǎng)基配成20%、10%、5%共3個濃度，同時設無血清MEM組為對照組。最后將0.5h采集的復方抗纖抑癌方藥物血清、2h采集的復方鱉甲軟肝片藥物血清與服藥前空白對照組血清進行比較，3種血清用無血清MEM培養(yǎng)基配成40%、20%、10%共3個濃度。

1.2.3 細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞HepG2培養(yǎng)于10%胎牛血清MEM培養(yǎng)液中，37℃5%CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液，4d～5d傳代，待細胞接近長滿時，用0.25%胰蛋白酶消化液消化傳代。

1.2.4 志愿者藥物血清對HepG2人肝癌細胞增殖的影響 采用MTT法檢測。取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞濃度為1×105ml－，接種于96孔板上，每孔100μl。24h后將原培養(yǎng)液吸棄，換無血清MEM培養(yǎng)液，每孔100μl，繼續(xù)孵育。24h后將培養(yǎng)液吸棄，復方鱉甲軟肝片組和抗纖抑癌方組分別加入含不同濃度藥物血清的條件培養(yǎng)基，每孔100μl。另設無血清MEM組(或服藥前空白血清組)為對照，每組設3個復孔。分別培養(yǎng)24h后，將原培養(yǎng)液吸棄，換無血清 MEM 培養(yǎng)液，每孔100μl，再加入5mg/ml MTT 每孔 20μl，孵育 4h，棄上清，每孔加DMSO 150μl，震蕩5min，充分溶解沉淀后，于酶聯(lián)免疫檢測儀492nm處檢測吸光度數(shù)值(OD值)。

1.2.5 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件處理。數(shù)據(jù)用珋x±s表示，計量資料的多組比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 1h、2hKX對HepG2人肝癌細胞增殖活性的影響

表1顯示，KX各組與MEM組比較，均有統(tǒng)計學意義，說明無論1h還是2h抽血，KX各組對HepG2肝癌細胞均有明顯的增殖抑制作用。整體來看，KX 1h各血清濃度對HepG2肝癌細胞的抑制效果強于2h，其中KX1h20%濃度時，抑制效果明顯優(yōu)于KX2h20%濃度，有統(tǒng)計學意義。

表1 不同時間點、不同濃度KX對HepG2人肝癌細胞增殖活性的影響

2.2 1h、2h復方鱉甲軟肝片藥物血清(BJ)對HepG2人肝癌細胞增殖活性的影響

表2顯示，BJ各組與MEM組比較，均有統(tǒng)計學意義，說明無論1h還是2h抽血，BJ各組對HepG2肝癌細胞均有明顯的增殖抑制作用。從數(shù)值上來看，存在BJ 2h各血清濃度對HepG2肝癌細胞的增殖抑制效果高于1h的趨勢。

表2 不同時間點、不同濃度BJ對HepG2人肝癌細胞增殖活性的影響

2.3 服藥后1h采血，2種藥物血清對HepG2人肝癌細胞增殖活性的影響

表3顯示，各治療組與MEM組比較，均有統(tǒng)計學意義，說明2種藥物血清對HepG2肝癌細胞均有明顯的增殖抑制作用。服藥后1h，KX在10%、5%濃度較BJ抑制作用強，其中5%濃度時有統(tǒng)計學意義。

2.4 服藥后2h采血，2種藥物血清對HepG2人肝癌細胞增殖活性的影響

表4顯示，各治療組與MEM組比較，均有統(tǒng)計學意義，說明2種藥物血清對HepG2肝癌細胞均有明顯的增殖抑制作用。服藥后2h，BJ在3個濃度點上均較KX抑制作用強，其中20%、10%濃度時有統(tǒng)計學意義。

表3 服藥后1hKX、BJ對HepG2人肝癌細胞增殖活性的影響

表4 服藥后2hKX、BJ對HepG2人肝癌細胞增殖活性的影響

2.5 增加0.5h抽血時間點后KX對HepG2人肝癌細胞增殖活性的影響

表5顯示，KX各組與MEM組比較，均有統(tǒng)計學意義，說明KX各組對HepG2肝癌細胞均有明顯的增殖抑制作用。KX 0.5h各濃度對HepG2肝癌細胞的抑制效果均明顯高于2h，有統(tǒng)計學意義。

表5 不同時間點、不同濃度KX對HepG2人肝癌細胞增殖活性的影響

2.6 0.5h的KX與2h的BJ對HepG2人肝癌細胞增殖活性的影響

表6顯示，整體來看，KX 0.5h各血清濃度對HepG2肝癌細胞的增殖抑制效果強于BJ2h，其中KX0.5h40%濃度時抑制效果明顯，有統(tǒng)計學意義;BJ各組與同濃度服藥前比較無統(tǒng)計學意義。

3 討論

藥物血清一直以來都是體外研究的重要手段之一，既往藥物血清主要來源于動物，對實驗動物藥物血清的采血時間點也有專門的研究［2］。隨著實驗技術(shù)的發(fā)展，研究者逐漸意識到實驗用材料的種屬問題［3］，它包括兩個層面的意義:一是種屬一致。應該使用同種動物的藥物血清作用于同種動物的細胞，避免與實驗不相關(guān)的因素干擾實驗結(jié)果;二是種屬相近。目前體外實驗多采用人來源的細胞，即應當采用最接近人體的實驗條件，實驗結(jié)果才能夠最大限度的接近實際。但藥物血清多數(shù)還是來源于動物，在人的細胞上添加動物血清作為刺激因素，存在不合理性。也有報道，采集人血清進行藥物血清實驗，也存在一定的問題，多數(shù)中藥的藥物代謝動力學不明，統(tǒng)一的采血時間點不能保證2種以上不同藥物在采血時均已達到該藥的峰值，藥物劑型不同，吸收代謝也不同。

表6 0.5h的KX與2h的BJ對Hep G2人肝癌細胞增殖活性的影響(作用48h)

本實驗選取2種藥物劑型，即湯劑和中成藥片劑，兩者藥物成分不同。健康志愿者3名，且3人的藥物血清不混合，測試2種藥物服用后不同時間點采集的藥物血清對腫瘤細胞的影響。結(jié)果顯示，2種藥物血清對HepG2人肝癌細胞均有增殖抑制作用，中藥湯劑KX的抑制作用隨著抽血時間的延長而遞減，其中0.5h抽血點各濃度藥物血清的抑制作用明顯較2h強(P<0.05);中成藥片劑BJ藥物血清的抑制效果則相反，存在2h比1h強的趨勢;在同一采血時間點或不同采血時間點上比較，2種藥物血清的抑制效果存在不同，甚至相反。研究表明，不同藥物在體內(nèi)的代謝時間不同，在采用人來源藥物血清實驗時需要注意，選取對照藥時應選取2種藥物作用都較強的時候進行比較，切實反映藥物療效。本實驗由于未設0.5hBJ，在以后的實驗中我們將做進一步完善。

［1］ 葉永安，朱陵群.中藥復方血清藥理學在中醫(yī)藥研究中應用的思考［J］.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2001，7(5):323-324.

［2］ 李儀奎.中藥血清藥理學實驗方法的若干問題［J］.中藥新藥與臨床藥理，1999，10(2):95-98.

［3］ 吳健宇，穆靜，李儀奎.血清藥理實驗中異種動物血清對細胞的毒性作用和滅活后的減毒作用［J］.中國藥理學通報，2000，16(1):118-119.