縊蟶YC-2蛋白的提取及抗氧化作用研究

趙艷景, 裴 波, 胡 虹, 王 穎

(1. 淮海工學院 江蘇省海洋生物技術重點建設實驗室, 江蘇 連云港 222005; 2. 連云港中醫藥高等職業技術學校, 江蘇 連云港 222006; 3. 中國藥科大學, 江蘇 南京 210009)

縊蟶YC-2蛋白的提取及抗氧化作用研究

趙艷景1, 裴 波1, 胡 虹2, 王 穎3

(1. 淮海工學院 江蘇省海洋生物技術重點建設實驗室, 江蘇 連云港 222005; 2. 連云港中醫藥高等職業技術學校, 江蘇 連云港 222006; 3. 中國藥科大學, 江蘇 南京 210009)

以新鮮縊蟶(Sinonovacula constricta)為材料, 經水萃取、(NH4)2SO4鹽析、DEAE離子交換層析、Sepharose CL-6B凝膠層析、凍干濃縮。結合SDS-PAGE電泳技術, 硫代巴比妥酸(TBA)法初步鑒定各個組分的抗氧化活性, 并用Bradford法進行蛋白的定量。結果表明, 80%飽和度(NH4)2SO4鹽析得到的組分經離子交換層析以及凝膠層析得到一個蛋白純品YC-2, 具有2個亞基, 大亞基的分子質量為61.23 ku, 小亞基的分子質量為45.39 ku, YC-2蛋白的分子質量為106.62 ku, 而且其具有較高的抗氧化活性,在0.627 g/L時對·OH清除率達99.7 %。

縊蟶(Sinonovacula constricta); 蛋白質; 分離純化; 抗氧化活性

縊蟶(Sinonovacula constricta)隸屬軟體動物門、瓣鰓綱、異齒亞綱、簾蛤目、竹蟶科, 廣泛分布于中國、日本和朝鮮等國的沿海地區, 中國北自遼寧、山東南至廣東、福建都有分布。其肉豐腴脆嫩, 鮮美清甜, 藥物功效顯著。隨著“藍色革命”時代的迅速發展,海水貝類養殖等相關研究日益興起, 縊蟶成為我國四大養殖貝類之一, 對它的研究和開發利用受到越來越多的科研工作者的重視[1]。已經有一些報道指出了縊蟶的藥物活性, 如抗氧化和抗腫瘤活性等[2,3]。目前國內對縊蟶蛋白的藥物活性研究的比較少。

在正常的生命過程中自由基為維持生命所必需,但自由基也是生物大分子、細胞和生物組織的危險的殺手。一般來說, 自由基具有很高的反應活性, 可造成對機體的損傷。多年來, 大量的實驗證明, 生命過程中的許多重要反應, 如多種酶催化的氧化還原反應、光合作用、生物發光等多與自由基有關; 多種疾病、生命的衰老亦涉及自由基反應學作用, 羥自由基(·OH)是目前所知活性氧中對生物體毒性最強、危害最大的一種自由基。·OH幾乎可以和生物細胞內存在的所有類型的分子反應, 而且具有很高的速率常數。在活性氧中, 它的危害性最大。水的脈沖射解、Haber-Weiss反應和Fenton反應, 甚至在超聲破碎和冷凍干燥的過程中都會產生·OH[4]。目前對羥自由基的研究已涉及不同的學科。尋找對羥自由基具有良好清除能力的清除劑, 特別是從常見的食品資源中進行篩選, 就是一個非常有必要的課題, 如此可以保證體內自由基的有效清除, 維護機體的正常機能, 也可預防一些疾病的發生[5～7]。現在雖然有很多人研究自由基, 但從海洋蛋白資源中獲取具有抗氧化活性蛋白質的研究報道很少, 只有Yu等[8]對海蜇蛋白抗氧化活性和李翠萍等[9]對白色霞水母蛋白抗氧化活性的初步研究的報道, 其他海洋生物蛋白質的抗氧化活性報道很少。趙艷景等[10]發現在縊蟶粗提物中存在活性比較強的物質。本研究旨在從中提取純化到比較純的活性物質, 為將縊蟶開發成為新的具有抗氧化作用的功能食品或新的抗氧化藥物先導化合物。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

縊蟶(Sinonovacula constricta)購于連云港通灌蔬菜活禽直銷市場。

1.1.2 試劑

2-脫氧-D-核糖, 美國 INALCO 公司; 硫代巴比妥酸(TBA) , 國藥集團化學試劑有限公司; Tris-Base,北京夏斯生物技術有限公司; 丙烯酰胺考馬斯亮藍G-250溴酚蘭考馬斯亮藍R-250, 加拿大BBI公司。其余試劑均為國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 縊蟶蛋白的粗提及分級鹽析

稱取50 g新鮮縊蟶肌肉組織, 放入組織勻漿機中攪成勻漿, 用大約 450 mL萃取緩沖液洗出勻漿,在4℃冰箱中充分浸取6 h。將萃取液于冷凍離心機中, 4℃下, 12 000 r/min離心30 min, 倒出上清并加水補充至500 mL。對提取到的蛋白水溶液進行分級鹽析, 硫酸銨的飽和度比分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%。 將分級鹽析得到的各個組分的沉淀再次溶解后裝入透析袋中, 加入適量的透析緩沖液于4℃透析24 h, 每4 h換1次透析液。將鹽析得到的各個組分的蛋白質離心去除變性的蛋白質后, 測量各組分蛋白溶液的體積。將離心后的上清冷凍或冷藏, 以備下一步純化。檢測分級鹽析各組分的蛋白含量以及蛋白的抗氧化活性, 制作出蛋白質鹽析曲線。

1.2.2 DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析

取上清液上樣DEAE Sepharose Fast Flow離子交換柱, 層析柱用10 mmol/L Tris-HCl, pH7.0 緩沖液平衡, 用10 mmol/LTris-HCl+1mol/NaCl, pH7.0進行離子強度線性梯度洗脫, 洗脫處理溫度 25℃, 流速為1.5 mL/ min , 組分在280 nm波長的吸光度大于0.03時開始收集, 每管收集3 mL。對收集到的不同組分進行蛋白質定量、定性分析, 并測量各個組分的活性, 將相對活性較大的組分透析除鹽后冷凍干燥。

1.2.3 Sepharose CL-6B凝膠層析

將DEAE層析得到的活性較強組分凍干粉用25 mmol/L Tris-HCl, pH7.5溶解, 4℃下10 000 r/min離心 5 min, 上 Sepharose CL-6B柱。用 25mmol/L Tris-HCl, pH7.5, 0.5 mL/min流速平衡柱, 上樣2mL,用上述緩沖液以 0.4 mL/min流速洗脫, 組分在 280 nm波長的吸光度值大于0.03時開始收集, 每管收集2 mL。對收集到的不同組分進行蛋白質定量、定性分析, 并測量各個組分的活性。選擇相對活性較大的組分做進一步分析。

1.2.4 純度測定[11,12]

采用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠(7.5%)電泳檢測分離得到的縊蟶蛋白質的純度。

常規聚丙烯酰胺凝膠電泳(native-PAGE) 電泳檢測分離得到的縊蟶蛋白質的純度。

1.2.5 抗氧化活性測定

采用硫代巴比妥酸(TBA)法[13,14]測定： 取 0.2 mL的FeSO4-EDTA混合液(10.0 mmol/L)于5 mL刻度試管中, 加入 0.5 mL的 2-脫氧核糖溶液(10.0 mmol/L)和0.6mL樣品, 用磷酸緩沖液(pH為7.4, 0.l mol/L)定容至 1.8 mL, 再加入 0.2 mLH2O2(10.0 mmol/L), 空白樣加入蒸餾水 0.2mL, 混勻后置于 37℃恒溫水浴中反應l h。然后加入質量分數為2.8%三氯乙酸(TCA)溶液1.0 mL, 在4 000 r/ min下離心20 min, 取上清液2.0 mL于另一支試管中, 加入質量分數為 1.0%硫代巴比妥酸(TBA)溶液 1.0 mL, 混勻后置沸水浴反應15 min, 冷卻后稀釋5倍, 在波長532 nm處測其吸光度值。提取物對羥自由基的清除效果用清除率(SA%)表示, 按下式計算：

SA(%)=[(Ac－As)/(Ac－A0)]×100%

式中：Ac為不加清除劑的吸光度;As為加入峰樣品后的吸光度;A0為試劑空白的吸光度。

1.2.6 蛋白含量測定

采用Bradford 檢測法[15,16]對所得到的蛋白質進行含量測定。

2 結果與分析

2.1 分級鹽析實驗結果

本實驗采用了30%～100%硫酸銨飽和度的分級鹽析。得到不同飽和度鹽析出來組分的蛋白含量和抗氧化活性, 如表1所示。

由表1可以看出, 70%鹽析組分的比活力較大。因此采用70%鹽析的組分進行下一步的分離純化。

表1 不同飽和度鹽析蛋白含量及活性Tab. 1 Protein content and antioxidant activity in samples prepared by (NH4) 2SO4 salting out

2.2 DEAE離子交換層析結果

用上述 70%硫酸銨飽和度鹽析組分濃縮后上DEAE離子交換層析, 洗脫圖譜見圖1。

從圖譜上可以看出, 在 280nm 檢測波長下, 一共洗脫出3個峰, 分別為D1、D2、D3將這3個峰樣品進行蛋白含量和抗氧化活性測定, 結果見表 2。其中D3的蛋白含量和活性最強, 作為進一步純化的樣品。

2.3 Sepharose CL-6B凝膠層析結果

將上述DEAE離子交換層析得到的組分D3進行Sepharose CL-6B凝膠層析。結果如圖2所示, 共得到3個組分, 分別命名為S1, YC-2, S3。

表2 DEAE分離的不同組分蛋白含量及活性Tab. 2 Protein content and antioxidant activity in proteins isolated by DEAE-cellulose chromatography

圖1 DEAE離子交換圖譜Fig. 1 DEAE Sepharose Fast Flow chromatography

圖2 Sepharose CL-6B凝膠層析圖譜Fig. 2 Sepharose CL-6B chromatography

將上述 3個樣品進行蛋白含量和抗氧化活性測定, 結果見表3。

由表3可見, YC-2抗氧化活性最強, 有待于進一步對其鑒定分析。

2.4 電泳結果

將上述得到的 YC-2蛋白進行 SDS-聚丙烯酰胺凝膠和常規聚丙烯酰胺凝膠電泳, 結果如圖3、4所示, 圖4中YC-2的常規電泳顯示一條帶, 而圖3顯示YC-2電泳出現兩條帶, 這說明此蛋白可能有兩個亞基。由蛋白質 marker的標準曲線可計算出, YC-2大亞基的分子質量為61.23 ku, 小亞基的分子質量為45.39 ku。因此, YC-2蛋白的分子質量為106.62 ku。

表3 Sepharose CL-6B分離的不同組分蛋白含量及活性Tab. 3 Protein content and antioxidant activity of proteins separated by Sepharose CL-6B chromatography

圖3 YC-2蛋白的SDS-PAGE電泳Fig. 3 SDS-PAGE of YC-2M為蛋白marker; 1為D3組分; 2為YC-2組分M： Proteins markers; Lane 1：D3; Lane 2： YC-2

圖4 YC-2蛋白的活性電泳 Fig. 4 Native-PAGE of YC-2

3 討論

近年來, 研究發現自由基與許多疾病如心血管病、癌癥及氧化脅迫的其他機能障礙密切相關[17,18]。人體細胞在氧化還原代謝過程中產生少量性質活潑的氧自由基(活性氧) ,主要有超氧陰離子自由基(O2-·)、羥自由基(·OH)等[19]。多項研究結果表明,腫瘤發生、輻射致癌、心腦血管疾病、器官的缺血再灌流、藥物中毒、人體衰老等過程都涉及自由基和活性氧[20]。近年來, 隨著海洋生物技術研究的發展, 不斷從海洋生物中發現一些具有抗氧化活性的化合物, 如海藻多糖、殼聚糖及其衍生物等[21,22], 但從海洋蛋白資源中獲取具有抗氧化活性蛋白質的研究報道很少。縊蟶是傳統的藥食兩用海洋貝類, 屬于軟體動物門雙殼綱真瓣鰓目平齒亞目, 在我國沿海地區普遍分布, 可入藥。早在《本草綱目》和《藥錄》中就記載了蟶肉的功效： 去邪熱、治煩悶、冷痢、熱痢、婦人產后虛損、虛熱[23], 趙艷景等[13]發現在縊蟶粗提物中存在抗氧化活性較強的物質。

本研究通過分級鹽析實驗, 發現在硫酸銨飽和度80%時, 縊蟶蛋白的比活力最強。用硫酸銨飽和度為80%時的樣品進行DEAE離子交換層析, 共得到3個組分, 其中活性最高的是在鹽濃度為 40%時洗脫下來的組分D3, 將D3透析凍干后, 進行凝膠層析共得到 3個組分 S1、YC-2、S3, 其中 YC-2組分的活性最高, 將 YC-2進行 SDS-PAGE和 native-PAGE,變性電泳結果為兩條帶, 非變性電泳結果為一條帶。因此判斷, YC-2有 2個亞基, 大亞基的分子質量為61.23 ku, 小亞基的分子量為45.39 ku, 所以YC-2蛋白的分子質量為106.62 ku。通過以上的分離純化步驟得到了一個電泳純的縊蟶蛋白, 并對其分子質量和活性做了初步的分析。但對于縊蟶蛋白YC-2作為一種新型的抗氧化物的分子機制及其結構、性質, 究竟是一種功能性蛋白還是一種新的酶, 還有待于進一步研究。

[1] 安賢惠, 李聯泰. 縊蟶研究現狀及發展前景[J]. 科學養魚, 2005, 1： 4-5.

[2] 雷曉凌, 吳紅棉, 范秀萍, 等. 縊蟶糖胺聚糖的提取分離及其體外抗腫瘤活性的初步研究[J]. 藥物生物技術, 2004, 11 (3) ： 146-149.

[3] 肖湘, 方明英, 張爾賢, 等. 縊蟶、織錦巴非蛤、二色裂江珧清除氧自由基作用研究[J]. 中國海洋藥物,2002, 3： 5-7.

[4] 孫存普, 張建中, 段紹瑾. 自由基生物學導論[M].北京： 中國科學技術出版社, 1999. 25-27.

[5] 陳瑗, 周玫. 自由基醫學[M]. 北京： 人民軍醫出版社, 1991.45-47.

[6] 趙保路. 氧自由基和天然抗氧化基[M]. 北京： 科學出版社, 1997.85-89.

[7] 祁克宗, 王林安. 自由基和生物抗氧化系統理論與外科學的關系[J]. 安徽學報, 1966, 23(2)： 171-174.

[8] Yu H H, Liu X G, Xing R E, et al. In vitro determination of antioxidant activity of proteins from jellyfish Rhopilema esculentum [J]. Food Chem, 2006, 95：123-130.

[9] 李翠萍, 于華華, 陳曉琳, 等. 白色霞水母蛋白抗氧化活性的初步研究[J]. 海洋科學, 2008, 32 (7) ：65-70.

[10] 趙艷景, 胡虹, 王穎. 3種蟶類水提液的抗氧化作用研究[J]. 安徽農業科學, 2008, 36(31)： 13 660-13 661.

[11] 郭堯君. 蛋白質電泳手冊[M]. 北京： 科學出版社,2000. 54-157.

[12] Diano M, Bivic Le. Production of highly specific polyclonal antibodies using a combination of 2-electrophoresis and nitrocellulose-bound antigen[M]. NJ： Protein Protocols Handbook Humana Totowa, 1996. 703-710.

[13] Andrews A T. Electrophoresis： Theory, Techniques and Biochemical and Clinical Applications[M]. 2nd., Clarendon, Oxford. 1986. 53-75.

[14] 韓鶴友, 何治柯, 曾云鶚. 羥自由基的分析研究進展[J]. 分析科學學報, 2001, 17： 45-47.

[15] Bradford M M A. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein of protein-dye binding [J].Anal Biochem, 1976, 72： 248-254.

[16] Red S M, Northcote D H. Minimization of variation in the response to different proteins of the Coomassie Blue G dye-binding assay for protei [J]. Anal Biochem,1981, (116)： 53-64.

[17] 劉立明, 劉麗虹, 宋功武, 等. 分光光度法測定Fenton 反應產生的羥自由基[J]. 湖北大學學報,2002, (4)： 326-328.

[18] 韓鶴友, 何治柯, 曾云鶚. 羥自由基的分析研究進展[J]. 分析科學學報, 2001, 17： 45-47.

[19] 范曉嵐, 楊軍, 糜漫天, 等. Βeta-胡蘿卜素的抗氧化作用與疾病預防[J]. 中國公共衛生, 2003, 4： 479-480.

[20] Cuzzocrea S, Riley D, Caputi A P, et al. Antioxidant therapy： a new pharmacological approach in shock , in flammation, and ischemia/ reperfusion injury [J].Pharmacol Rev, 2001, 53： 135-139.

[21] 張全斌, 于鵬展, 周革非, 等. 海帶褐藻多糖硫酸酯的抗氧化活性研究[J]. 中草藥, 2003 , 34： 824-826.

[22] Xing R E, Yu H H, Liu S, et al. Antioxidant activity of differentl regioselective chitosan sulfates in vitro [J].Bioorg Med Chem, 2005, 13 (4)： 1 387-1 392.

[23] 張金鼎. 海洋藥物與效方[M]. 北京： 中醫古籍出版社, 1998.

Extraction of YC-2 from Sinonovacula constricta and its antioxidant activity

ZHAO Yan-jing1, PEI Bo1, HU Hong2, WANG Ying3
(1. Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China;2. LianYunGang Higher Vocational Technical College of Traditional Chinese Medicine, Lianyungang 222005,China; 3. China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China)

Jul., 30, 2009

Sinonovacula constricta; protein; separation and purification; antioxidant activity

Protein YC-2 was isolated from Sinonovacula constricta by water extraction, ammonia sulphate precipitation (80% saturation), ion exchange chromatography, and gel chromatography, and concentrated by freeze drying. SDS-PAGE and the thiobarbituric acid (TBA) method were used to identify various components and their antioxidant activities in Sinonovacula constricta extracxts. We found that YC-2, a dimeric proteins with a 61 ku large subunit and a 45 ku small subunit, had a high oxidation resistance, the removal rate on ? OH being 99.7 % at 0.627 g/L.

S185

A

1000-3096(2010)06-0034-05

2009-07-30;

2009-11-20

江蘇省海洋生物技術重點建設實驗室開放基金項目(HS07014); 江蘇省基礎研究計劃(自然科學基金)——企業博士創新項目(BK2009641); 淮海工學院引進人才科研啟動基金( KQ07018)

趙艷景(1976-), 女, 河北保定人, 博士, 講師, 研究方向： 海洋生物活性物質, 電話： 13851263305, E-mail： zhaoyanjing1976@163.com

(本文編輯: 康亦兼)