基因工程在黃瓜育種中的應用

盛 強 史湘華

（遼寧省農業技術學校 110161）

黃瓜是我國主要的蔬菜作物。近年來，隨著我國黃瓜栽培面積的逐漸擴大，黃瓜連作障礙和種性退化現象嚴重。因此，新品種的選育就成為黃瓜可持續生產的關鍵。黃瓜品種的選育工作始于上世紀50年代末；60年代黃瓜育種工作的重點是選育抗病育種，人們利用傳統的常規選育方法育成了津研系列黃瓜；70年代在常規品種選育的基礎上進行了黃瓜雜種一代優勢利用的研究；到了80年代黃瓜育種不僅在抗病性，而且在早熟性、豐產性和品質等方面也有較大提高。

傳統的育種方法是通過雜交、自交和回交等手段培育新品種。育出一個新品種通常需要5～8年，周期長、成效低，并且受種質資源的限制，可供利用的性狀資源差異越來越小，所以僅靠現有的種質資源和常規育種方法很難使新品種在抗病性、品質方面有較大突破。隨著細胞工程和基因工程技術等一系列現代生物技術的建立，生物技術已成為當今世界發展最快、最活躍的高新技術。20世紀90年代，基因工程技術開始應用于選育黃瓜新品種，現已呈現出良好的發展前景?；蚬こ碳夹g是在分子水平上對基因進行直接操作，可在優良的遺傳背景下只改變個別性狀而不影響其它性狀，實現定向改良植物遺傳性狀，提高育種的目的性和可操作性。利用基因工程技術選育黃瓜品種，在一定程度上解決了黃瓜種質資源有限、性狀資源差異不明顯、培育新品種年限長的難題。在黃瓜育種上，應用較多的基因工程技術有分子標記技術和轉基因技術。

1 分子標記技術

分子標記是繼形態標記、細胞標記和生化標記之后發展起來的一種新的遺傳標記形式。同前幾種標記相比，分子標記直接以DNA的形式表現，數量多且多態性高。許多分子標記表現為顯性、共顯性，能夠鑒別出純合基因型和雜合基因型，提供完整的遺傳信息供育種實踐利用。1980年，Bostein和White等首次提出用RFLP作為遺傳標記構建遺傳連鎖圖譜之后，相繼出現了20多種DNA分子標記方法，它們的應用已覆蓋了生命科學的許多領域。按其技術原理，分子標記可分為3大類：第1類是以分子雜交為基礎的標記技術，主要是RFLP；第2 類是以 PCR（Polymerase Chain Reaction）反應為基礎的一系列分子標記技術，如RAPD（Random Amplified PolymorphicdNA）、SSR（Simple Sequence Repeat）、SCAR （Sequence Characterized Amplified Regions）、STS（Sequence Tagged Site）等；第 3 類是以酶切和PCR為基礎的分子標記技術，如AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）、CAPS（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）。 目前應用較多的是RFLP，RAPD，AFLP及 SSR。RFLP是指不同生物的DNA經限制性內切酶消化后，通過分子雜交檢測酶切同源片段大小上的差異。這種差異是DNA分子堿基突變引起的限制性內切酶酶切位點的缺失或增加，以及DNA分子片段插入、重復、缺失等行為造成的。RFLP標記一般為共顯性，但RFLP操作較復雜、費用較高。RAPD是一種運用隨機引物擴增基因組，尋找多態性DNA片段作為分子標記的新技術。RAPD技術建立在PCR技術基礎之上，利用一系列不同的寡聚核苷酸為引物，對所研究的基因組DNA進行PCR擴增。RAPD技術程序簡單、快捷、成本低。AFLP標記的要點是選擇性地擴增基因組DNA的限制性酶切片斷。首先用兩個（也可一個或多個）限制性內切酶消化基因組DNA，再用與這兩個酶酶切末端配對的兩個雙鏈人工接頭連接限制性酶切的片段作為擴增反應模板，其實質是RFLP與PCR結合的一種技術。AFLP多態性強、穩定性高、重復性好。該技術的缺點是通常需用同位素，危害人體健康，成本較高。SSR也叫微衛星DNA，是指DNA分子中2～4個堿基組成的簡單重復序列，其分布遍及人類和動植物的所有染色體及染色體各個片段。不同品種間其重復單位數有極高的變異。根據其兩端特異序列來設計引物，通過PCR擴增基因組中的重復序列位點，分析基因組的多態性。該標記具有RAPD標記的所有優點，且多態性更豐富，同時又克服了RAPD缺點，具有較高的穩定性。但要獲得SSR引物需要進行大量克隆、測序和雜交驗證工作。

分子標記技術在黃瓜上的應用沒有十字花科、茄科作物普遍，但在黃瓜遺傳及育種的研究中起著重要作用。遺傳圖譜是植物遺傳育種及分子克隆等許多應用研究的理論依據和基礎，傳統的遺傳標記技術標記數目少，難以形成一個較為完整的連鎖圖。RFLP自發明后就被廣泛用于植物的遺傳作圖，而RAPD標記多態性豐富，操作簡單，用于構建遺傳圖譜比RFLP更為快速、經濟。對那些已建立了RFLP圖譜的植物，可以利用RAPD技術找到新的標記補充到RFLP圖譜中。AFLP雖然建立的時間較短，但因多態性信息非常豐富，同時重演性和可信度又比RAPD高得多，是構建飽和圖譜的有力工具。目前，通過RFLP、RAPD、SCAR和STS標記技術已構建了黃瓜等20種蔬菜遺傳圖譜，其中番茄、馬鈴薯、甘藍等蔬菜作物的圖譜已趨于飽和。

Staub等利用分子標記技術將來源于國家植物種質系統 （NPGS）的922份黃瓜種質材料與118份栽培黃瓜材料進行了分析比較，發現栽培材料的遺傳背景十分狹窄，而前者的遺傳多樣性較豐富。借助分子標記技術，可以將來源于NPGS黃瓜中的基因通過回交引入栽培黃瓜，進行品種改良。

利用分子標記技術進行蔬菜品種鑒定不受環境、取材部位、時間等因素影響，而且信息量大，可以準確、快速區分出形態標記難以鑒別的細微差異。品種鑒定首先需要構建品種的標準DNA指紋圖譜，將需要鑒定的品種的指紋與標準指紋進行比較分析，即可知道品種的純度和真偽。

由于受環境因素影響很大，傳統的基因定位方法進行基因標記所得的遺傳圖譜可靠性較低。而利用分子標記技術可以提高遺傳分析的準確性和選種、育種的有效性。國艷梅通過AFLP技術對控制黃瓜苦味的基因bi進行了引物篩選，得到了兩個有效引物。Hallden找到了與抗病基因緊密連鎖的PCR標記。張海英用RAPD技術找到了歐洲溫室類型黃瓜材料的特征譜帶。

目前，利用分子標記技術在黃瓜遺傳圖譜構建、種質資源、基因定位、抗病育種和品種的純度鑒定等方面研究取得了一定的進展。如何利用分子標記技術挖掘和利用黃瓜的種質資源中的優良基因是將來分子生物學在黃瓜品種改良上應用研究的重點。

2 轉基因技術

基因工程是在重組DNA技術上發展起來的一門新技術，它是以分子遺傳學理論為基礎，綜合了分子生物學、微生物學和植物組織培養等現代技術和方法。轉基因技術是指一種或幾種生物體的基因或載體先在體外按照人們的設計拼接，然后轉入另外一種生物體內，使之依照人們的意愿遺傳，表達出人們所希望的新性狀。即將外源目的基因經過或不經過修改，通過生物、物理或化學的方法導入另外一種生物體內，以改良其性狀，得到優質、高產、抗病蟲及抗逆性強的新品種。

目前轉入外源基因的方法主要包括根癌農桿菌介導的外源基因轉移法和外源基因直接導入法，后者又包括EFG法、電激法、生物射彈法（基因槍法）、花粉管道法、微注射法等等。EFG法、電激法、脂質體法均以原生質為受體，操作需格外精細；基因槍法雖然導入效率高，適用對象廣，但因設備較貴，應用受到限制；花粉管通道法不需要精密儀器，操作相對簡易，可在大田條件下運用，較適合我國國情，發展前景較好。

到目前為止，已進行轉基因并獲得轉基因植株的蔬菜有番茄、馬鈴薯、胡蘿卜、芹菜、菠菜、生菜、甘藍、花椰菜、大白菜、黃瓜、西葫蘆、豇豆、茄子、辣椒、石刁柏等，所改良的農藝性狀包括抗蟲、抗病、抗除草劑、延熟保鮮及其它品質。黃瓜體細胞再生與轉基因技術可將外源的抗病、抗蟲、抗逆及特有品質等有效基因導入植物體，從而產生具有新性狀的植株，培育出新的抗病、抗蟲、抗逆等優良品種。轉基因黃瓜不僅可以保留原來優良的豐產性、商品性，而且獲得了新的抗病性或抗除草劑等特性，可以大幅度節約生產成本，提高生產效率。目前，已經發現黃瓜轉水稻幾丁質酶基因植株可以提高對灰霉病的抗性，還可以產生對CMV的抗性。病毒病是黃瓜最主要的病害之一，近年來已實現了把抗病毒病基因轉入到黃瓜體內。鰈魚科的抗凍基因轉入黃瓜中，可提高黃瓜抗冷性，為發展冷凍保鮮蔬菜提供了條件。天津科潤黃瓜研究所正在利用建立的黃瓜轉基因技術，開展黃瓜耐鹽基因、抗除草劑基因的轉化研究，并已經取得階段性成果。

轉基因工程在黃瓜遺傳育種、品質改良上的應用前景是十分樂觀，最近十幾年來已取得很大進展，轉基因蔬菜成果已經在生產上得到應用。另外，基因工程帶來明顯經濟效益的同時，也有可能產生一些潛在的負面影響，比如轉基因產品的食用安全性以及是否可能帶來生態破壞等。雖然我們已經建立了相關法規和條例，并對產品安全性進行了評估和監控，但仍要加強管理和監督，加大宣傳力度，使轉基因蔬菜有更加廣闊的發展前景。

目前，生物技術在黃瓜新品種選育上還沒有得到普遍應用，有些技術還處于研究階段，如利用分子標記進行系譜分析和定位，品系、品種和雜種的鑒定及品質、抗病性鑒定等還只是作為黃瓜育種的輔助手段。雖然轉基因工程在抗性、品質改良方面有一定的應用，但仍然存在著許多不容忽視的問題，如轉化率低，結果不穩定等。因此，我們在加強轉基因育種研究的同時要解決好基因工程與常規育種的關系，使其盡快轉化為生產力。我們相信，生物技術必將對黃瓜育種方法產生深遠的影響，為蔬菜產業及整個農業的發展做出越來越大的貢獻。