三苯基錫對青萍生長及酶活性的影響

宋志慧，劉歌

青島科技大學環境與安全工程學院，青島266042

三苯基錫對青萍生長及酶活性的影響

宋志慧*，劉歌

青島科技大學環境與安全工程學院，青島266042

以青萍（Lemna mino）為實驗生物，通過研究不同濃度（0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20mg·L-1）的三苯基錫（TPT）對青萍生長發育及過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）活性的影響，初步探討了TPT對水生浮萍植物的毒性作用，以期為及時發現并排除TPT污染提供理論和直觀依據.實驗結果表明：培養4d后，TPT對青萍葉片生長量的半數抑制濃度（IC50）為0.10mg·L-1；CAT、POD活性隨TPT處理濃度的升高顯著升高（各暴露組與對照組均差異顯著，p＜0.05）.結果顯示，TPT對青萍具有明顯的毒性作用，CAT和POD活性的變化可作為反映TPT污染脅迫的敏感指標.

三苯基錫；青萍；過氧化氫酶；過氧化物酶；IC50

1 引言（Introduction）

有機錫化合物作為人為引入環境的毒性最大的化合物之一（Lu et al.,2004），已經引起了人們的普遍重視.目前有機錫化合物已廣泛存在于環境各介質中，許多國家均將其列為優先控制的有毒污染物（李紅莉等，2003）.有機錫化合物不僅對水生生物具有嚴重影響，而且對陸生生物甚至人類都會產生危害.對水生生物影響最大的有機錫化合物主要是毒性較大的三丁基錫（TBT）和三苯基錫（TPT），它們會從船體防污油漆中直接釋放到水中，使碼頭、湖泊、沿岸海域的水、沉積物和生物受到污染，同時研究表明，離岸較遠的水域也會受到有機錫的污染（高峻敏和鄭澤根，2003）.調查表明，一些地區對TPT殺菌劑的使用量越來越大，噴灑的TPT農藥會隨著雨水、徑流等直接進入江河湖泊中，使地表水受到污染（Kannan and Lee,1996）.

浮萍科植物廣泛存在于各種水體中，通常能夠靈敏地反映水體污染狀況，研究TPT對水生浮萍科植物生理指標的影響具有重要意義.青萍（Lemna minor）屬浮萍科，具有分布廣、繁殖快、易于打撈等優點，是水生毒理學研究中常用的實驗材料，目前已被廣泛應用于廢水處理和水生植物污染生態學等研究中（K?rner et al.,2003;Cheng et al.,1998;宋志慧和黃國蘭，2005）.然而有關TPT對青萍的影響尚未見報道.

國內外許多學者已對TPT對海洋生物的毒性效應進行了很多研究（徐明德和杜春梅，2001;王永芳，2003;Botton et al.,1998），但對淡水生物的研究相對較少.本實驗以青萍作為實驗生物，通過不同濃度的TPT對青萍生長發育及抗氧化酶活性的影響，初步探討了TPT對水生植物的毒性作用，以期為及時發現并排除TPT的污染提供理論和直觀依據.

2 材料與方法（Materials and methods）

2.1 實驗材料

青萍（Lemna minor），采自福州某無污染荷花池，在此荷花池中檢測未發現TPT的存在.挑選個體健壯、葉片完好的植株在光照培養箱中，（26±2）℃、14/10光暗比，（4000±100）Lux條件下用1/2 Hoagland培養液（Song and Huang,2005）培養.當青萍數量達到實驗所需時，篩選出健康的植株，選擇葉片數相同、生長狀態一致的青萍進行毒性作用實驗.

2.2 實驗設計

實驗以1/2 Hoagland培養液為稀釋液，分別加入一定量的TPT，使TPT的濃度為0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20mg·L－1（以Sn計），以培養液為對照，在250mL燒杯中分別加入上述實驗液100mL，每個濃度設3個重復，每個燒杯放40個葉片，實驗進行4d，每2天換1次處理液,同時記錄燒杯中的青萍葉片數.

2.3 實驗方法

2.3.1 TPT對青萍的4d-IC50實驗

根據實驗所設濃度每2d紀錄青萍葉片數.其4d的IC50的計算公式如下（Song and Chen,1998）：

速率Vt：

式中：t為時間（d）；Nt為時間t時青萍葉片數；N0為初始時青萍葉片數；Vt為時間t時的生長速率；In為染毒組的抑制百分率；Vn為染毒組處理n的生長速率；V0為對照組的生長速率.將In與實驗液化合物濃度的對數進行線性回歸，求出半數抑制濃度（IC50）.進行回歸分析，其中，相關系數r為正值，為正相關；r為負值，為負相關；顯著性水平p＜0.05為顯著相關，p＜0.01為極顯著相關.

記錄青萍的植物體數時，為避免主觀判斷，判斷標準為在10位放大鏡下觀察青萍，只要新的植物體伸出母體的邊緣，就將其計算在內.對于老化而死亡、失去色素變白變黃的個體不記錄.青萍植物體數的增加表示青萍的生長，各處理組與對照組的差異表示TPT對青萍的毒性效應（徐楠等，2002）.

2.3.2 TPT對青萍酶活性的影響

酶是活細胞內產生的具有高度專一性和催化效率的蛋白質，廣泛存在于各種細胞中，催化細胞生長、代謝等生命過程中幾乎所有的化學反應.過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）是生物體中廣泛存在的酶，國內外大量研究表明，當植物處于逆境條件下，體內大量積累的活性氧可誘導膜脂過氧化，使細胞膜最先受到傷害.而POD和CAT是植物體內重要的保護酶系統，二者相互協調，可有效地清除代謝過程中產生的活性氧對脂膜的過氧化及其他傷害過程（宋美芳和李杰，2005）.本研究選擇這兩種酶作為指示TPT對青萍生理生化指標的影響.

實驗懸浮液的制備（荊家海和丁鐘榮，1981）：用電子分析天平稱量青萍，加入2mL pH 6.4的0.2mol·L－1磷酸緩沖液，研磨后將研缽中的內含物用蒸餾水定容至50mL，保存在4℃下備用.為測定POD的活性，取25mL懸浮液用10%硝酸鈣溶液定容至50mL，在定期搖動下停放30～40min后使用.

CAT的測定：取10mL青萍的酶懸浮液，加溫到20℃后，加入5mL 0.1mol·L－1過氧化氫，經過5min后，加入5mL硫酸（1:9）終止反應后加入1mL 20%的碘酸鉀，滴入3滴10%鉬酸銨作為催化劑，在1mL 0.5%淀粉存在下，用0.02mol·L－1的硫代硫酸鈉滴定，從而計算出酶的活性.過氧化氫酶的活性按參考文獻（荊家海和丁鐘榮，1981）進行計算.

POD的測定：取1mL左右的青萍的酶懸浮液置入干燥比色管中，加入7mL蒸餾水，1mL 0.3%愈創木酚，搖勻，浸入20℃水中，當對照試管的溫度達到水浴溫度時，加入0.5mol·L－1的過氧化氫溶液1mL.此后將溶液立即搖勻，并仍放入水浴中.加入過氧化氫后15min，用波長440nm比色皿厚度10mm的分光光度計，準確測定光密度.過氧化物酶的活性按參考文獻（荊家海和丁鐘榮，1981）進行計算.

2.4 統計方法

數據以均值±標準偏差表示.采用SPSS 16.0進行方差分析.

3 結果（Results）

3.1 TPT對青萍植株體生長的影響

TPT對青萍株體的毒性作用如表1所示.同一時間下，隨TPT濃度的升高，青萍葉片數呈逐漸降低趨勢，抑制百分率呈逐漸升高趨勢，表明TPT對青萍生長具有明顯毒性作用.

表1 TPT對青萍的毒性作用（葉片數）Table 1Toxic effects of TPT on Lemna minor（the number of leaf）

通過將TPT濃度的對數（lnC）為橫坐標，抑制百分率為縱坐標做標準曲線，用圖解法得到TPT對青萍4d的IC50值為0.10mg·L－1.

從實驗結果可看出，在4d的處理時間內，隨著處理濃度的增加，TPT對青萍生長的抑制作用逐漸增強，相比于對照組，各暴露組中青萍的生長速率明顯下降.在實驗過程中觀察到，當TPT濃度高于0.12mg·L－1時，青萍周圍出現白色沉積物，培養液變為白色渾濁物，青萍出現葉片輕微變黃，脫根和植株分離現象，濃度增大時，開始出現枯死葉片，到0.20mg·L－1時，葉片數開始停滯，新生葉片長不大.這主要是因為TPT主要通過根和葉吸收，并傳導進入青萍體內，影響細胞分裂，從而造成青萍的生長停止.

實驗結果說明，TPT對青萍生長具有明顯的毒性作用，由于青萍等浮萍植物處于水生食物鏈的低端，因此TPT可能會通過生物濃縮現象經食物鏈的逐級放大傳遞給更高營養級的生物，甚至可能影響到人類的健康.

3.2 TPT對青萍抗氧化酶活性的影響

TPT對青萍CAT活性的影響如圖1所示.從圖1可以看出，相同培養液條件下，隨著TPT處理濃度的增加，CAT活性顯著升高，各暴露組與對照組均差異顯著（p＜0.05）.

TPT對青萍POD活性的影響如圖2所示.與CAT類似，相同培養液條件下，隨著TPT處理濃度的增加，POD活性顯著升高，各暴露組與對照組均差異顯著（p＜0.05）.

CAT和POD作為生物體內的抗氧化系統酶，具有非常重要的生理功能，其中最為主要的就是參與活性氧代謝過程.在活性氧代謝過程中，CAT和POD可以使H2O2等過氧化物發生歧化生成水和氧分子（Van Breusegem et al.,2001），使其維持在低水平上，保護膜透性，減少植物受到的損傷（Gelain et al.,2008）.在環境脅迫等逆境情況下，生物體內廣泛存在活性氧爆發現象，導致自由基增多，使細胞膜產生過氧化，導致細胞膜的破壞和損傷，而CAT和POD是體內清除自由基的酶促防御系統之一（Jin et al.,2008）.CAT和POD活性隨TPT處理濃度顯著增加是因為CAT和POD在TPT脅迫的逆境情況下機體為避免過氧化產生了大量CAT和POD，組成了酶促防御系統，保護了膜透性，從而減少了植物受到的損傷（馬文麗等，2004）.

實驗結果可以看出，0.04mg·L-1TPT污染即可導致青萍CAT和POD發生顯著變化，因此青萍CAT和POD活性可作為反映水體TPT污染的敏感脅迫指標.

致謝：本論文得益于社會科學規劃項目（03CJZ03）、山東省博士基金項目（03DS125）、山東省高等學校實驗技術研究項目（2005-188），特此表示感謝.

Botton M L,Hodge M,Gonzalez T I.1998.High tolerance to tributyltin in embryos and larvae of the horseshoe crab,Limulus polyphemus［J］.Estuaries and Coasts,21（2）:340-346

Cheng J Y,Stomp A M,Classen J J,Barker J C,Bergmann B A.1998.Nutrient removal from swine wastewater with growing duckweed［R］.ASAE annual international meeting

Gao J M,Zheng Z G.2003.Distribution and fate of organotin compounds in environmental system［J］.Shanghai Environmental Sciences,22（Supplement）:22-25（in Chinese）

Gelain D P,de Bittencourt,Pasquali M A,Zanotto-Filho A,de Souza L F,de Oliveira R B,Klamt F,Moreira J C.2008.Retinolincreasescatalaseactivityandproteincontentbya reactive species-dependent mechanism in Sertoli cells［J］.Chemico-Biological Interactions,174（1）:38-43

Jin X,Yang X,Islam E,Liu D,Mahmood Q.2008.Effects of cadmiumonultrastructure andantioxidative defense systemin hyperaccumulator and non-hyperaccumulator ecotypes of Sedum alfredii Hance［J］.Journal of Hazardous Materials,156（1-3）:387-397

JingJH,DingZR.1981.AnalyticalMethodofPlant Biochemistry［M］.Beijing:Science Press,197-207（in Chinese）

KannanK,Lee RF.1996.Triphenyltinanditsdegradation products in foliage and soils from sprayed pecan orchards and in fishfromadjacentponds［J］.EnvironmentalToxicologyand Chemistry,15（9）:1492-1499

K?rner S,Vermaat J E,Veenstra S.2003.The capacity of duckweed to treat wastewater:ecological consideration for a sound design［J］.Journal of Environmental Quality,32（5）:1583-1590

Li H L,Gao H,Xu X L.2003.The study on the environmental behavior of organic tin compounds［J］.Environmental Science Trends,（2）:15-17（in Chinese）

LuHT,LiHB,ChenF,WongMH,JiangY.2004.Determinationoftriphenyltinanditsmetabolitediphenyltinin culture medium by high-performance liquid chromatography with UV detection［J］.Chromatographia,60（1-2）:113-116

Ma W L,Jin X D,Wang Z H.2004.Effect of cadmium on seed germination,growth of seedling and antioxidant enzymes of rye and wheat［J］.Journal of Agro-Environmental Science,23（1）:55-59（in Chinese）

Song M F,Li J.2005.The contaminative status of organic tin compoundsanditsreproductivetoxicity［J］.Journalof Environmental and Occupational Medicine,22（6）:549-551（in Chinese）

Song Z H,Chen T Y.1998.Toxicity of tributyltin to LemnaminorL.andAzollafiliculoidesLamk［J］.Bulletinof Environmental Contamination and Toxicology,60（2）:318-322

SongZH,HuangGL.2005.Applicationofduckweedin aquatic ecotoxicology［J］.Environmental Science and Technology,28（1）:94-96（in Chinese）

Song Z H,Huang G L.2005.Toxic effect of triphenyltin on Lemnapolyrhiza［J］.AppliedOrganometallicChemistry,19:807-810

Van Breusegem F,Vranova E,Dat J F,Inze D.2001.The role of active oxygen species in plant signal transduction［J］.Plant Science,161（3）:405-414

WangYF.2003.Thecontaminativestatusoforganictin compoundsanditstoxicity［J］.ChineseJournalofFood Hygiene,15（3）:244-247（in Chinese）

Xu M D,Du C M.2001.Toxic effects of organic tin on Dicrateriasp.［J］.JournalofOceanographyofHuanghai&Bohai Seas,19（1）:66-69（in Chinese）

Xu N,Shi G X,Du K H,Zhang X L,Zeng X M,Zhou H W.2002.The study on effect of Hg,Cd and their combined pollution in leaves of lemna minor L.［J］.Journal of Nanjing NormalUniversity（NaturalScience）,25（3）:109-115（in Chinese）

中文參考文獻

高峻敏,鄭澤根.2003.環境系統中有機錫化合物的分布和歸宿［J］.上海環境科學,22（增刊）:22-25

荊家海,丁鐘榮.1981.植物生物化學分析方法［M］.北京:科學出版社,197-207

李紅莉,高虹,徐曉琳,王倩,王艷,鄒曉東,馮素萍.2003.有機錫化合物在中國環境行為的研究狀況［J］.環境科學動態,（2）:15-17

馬文麗,金小弟,王轉花.2004.鎘處理對烏麥種子萌發幼苗生長及抗氧化酶的影響［J］.農業環境科學學報,23（1）:55-59宋美芳,李杰.2005.有機錫的污染及其生殖毒性［J］.環境與職業醫學,22（6）:549-551

宋志慧,黃國蘭.2005.浮萍在水生態毒理學中的應用［J］.環境科學與技術,28（1）:94-96

王永芳.2003.有機錫化合物的污染及其毒性［J］.中國食品衛生雜志,15（3）:244-247

徐明德,杜春梅.2001.有機錫對金藻（Dicrateria sp.）的毒性效應［J］.黃渤海海洋,19（1）:66-69

徐楠,施國新,杜開,張小蘭,曾曉敏,周紅衛.2002.Hg、Cd及其復合污染對浮萍葉片的毒害研究［J］.南京師范大學學報（自然科學版）,25（3）:109-115◆

ToxicEffectsofTriphenyltinontheGrowthandtheRelated Enzymic Activities of Lemna minor

SONG Zhi-hui*，LIU Ge

College of Environment and Safety Engineering,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao 266042

Toxic effects of triphenyltin（TPT）（0,0.04,0.08,0.12,0.16,0.20mg·L-1）on the growth and the related enzymic（catalase（CAT）,peroxide（POD））activities of Lemna minor was researched in this study.Results showed that the 96h IC50of TPT for the number of Lemna minor’s leaf was 0.10mg·L-1.The CAT and POD activities increased significantly with the increasing of TPT concentrations（compared with the control,p＜0.05）.The results indicated that TPT has toxic effect on Lemna minor and the activity of CAT and POD can be used as the sensitive indicator of TPT in aquatic environment.

triphenyltin（TPT）；Lemna minor；catalase（CAT）；peroxide（POD）；IC50

25 February 2009accepted5 April 2009

1673-5897（2010）1-118-05

X171.5

A

2009-02-25錄用日期：2009-04-05

山東省社會科學規劃項目（No.03CJZ03）；山東省博士基金項目（No.03DS125）；山東省高等學校實驗技術研究項目（No.2005-188）

宋志慧（1972—），副教授；*通訊作者（Corresponding author），E-mail:songhuey@sina.com

宋志慧（1972—），男，博士，副教授.