皮膚誘導再生材料的研究進展與挑戰

馬 列,高長有,李明忠,白 倫,沈家驄

(1.浙江大學高分子科學與工程學系教育部高分子合成與功能構造重點實驗室,浙江杭州 310027)(2.蘇州大學現代絲綢國家工程實驗室,江蘇蘇州 215021)

皮膚誘導再生材料的研究進展與挑戰

馬 列1,高長有1,李明忠2,白 倫2,沈家驄1

(1.浙江大學高分子科學與工程學系教育部高分子合成與功能構造重點實驗室,浙江杭州 310027)
(2.蘇州大學現代絲綢國家工程實驗室,江蘇蘇州 215021)

高長有教授

燒傷、機械創傷等導致的皮膚缺損及功能喪失是常見的臨床難題之一。介紹了皮膚缺損修復的研究背景和皮膚修復材料的發展歷史。通過對國內外原位誘導皮膚再生材料研究現狀的分析,總結了影響皮膚誘導再生材料性能的關鍵科學問題,即原位誘導血管化與原位誘導細胞遷移,并歸納介紹了相應的材料設計與改性方法。最后根據皮膚誘導再生材料存在的不足對未來皮膚誘導再生材料的研究與發展進行了展望。

生物材料;皮膚缺損;誘導再生;血管化;細胞遷移

皮膚修復材料的研究背景與發展歷程

皮膚是人體最大的器官,由表皮、真皮和皮下組織等構成,并含有附屬器官(汗腺、皮脂腺、毛囊)以及血管、淋巴管、神經等(圖1)[1]。皮膚可避免機體內水分和電解質的喪失,保護機體免受外界環境中的輻射以及化學物質、細菌和病毒的直接危害,調節體內水分和其它物質的平衡,調節體溫并感知外界信息的作用[2-3]。然而,大面積暴露于外部環境的皮膚組織時刻可能受到損傷,其中燒傷、機械創傷以及慢性疾病導致的潰瘍(如糖尿病)是造成皮膚缺損及功能喪失的主要原因。據世界衛生組織(WHO)估計,中國每年約有9×106燒傷病人。大面積燒傷、皮膚慢性潰瘍、皮膚癌以及白癜風、糖尿病性潰瘍、褥瘡等可以通過皮膚移植來治療的各種疾病都需要有足夠的皮膚進行修復,全國每年需要進行皮膚移植的病例大約在3.2×106人次以上。傳統的皮膚修復材料包括敷料、異種皮移植、異體皮移植和自體皮移植等。迄今為止,自體皮移植仍然是臨床治療全層皮膚缺損最有效的方法。然而對于大面積燒傷患者,往往存在供皮部位不足的問題,需要經過多次移植才能治愈。因此開發出能有效促進創面愈合與皮膚組織再生的皮膚修復產品具有重要的意義。

圖1 皮膚結構示意圖Fig.1 Schematic illustration of skin structure

根據皮膚的結構,皮膚修復材料可依次分為表皮替代物、真皮替代物和全層皮膚替代物。1975年,Rheinwald和Green首先實現了表皮細胞的體外大量擴增[4],使表皮層的移植成為可能[5];1981年,O'Connor首次成功地實現了體外培植的自體表皮細胞膜片在皮膚創面的移植[6]。該方法的最大優點在于通過一小塊自體皮膚就可以在體外培植大面積的表皮膜片,以用于創面移植。

對于全層皮膚缺損患者,表皮膜片移植的治愈效果非常有限。在缺少真皮層的情況下,移植的表皮膜片易發生脫落和產生水皰,而且愈合過程常伴隨疤痕的增生和嚴重的收縮。因此,真皮層在創面愈合過程中起著非常重要的作用,真皮層的存在能大大減少愈合部位的疤痕產生,降低創面的收縮程度,并且提高其愈合速度[8]。隨著生命科學、材料科學以及醫學的發展,組織工程化真皮得到快速發展。其中Advanced Tissue Sciences公司生產的Dermagraft 是具有代表性的組織工程真皮。將新生兒包皮成纖維細胞種植于聚乙醇酸/聚乳酸(PGA/PLA)網狀支架中,并于體外培養2～3周,從而在PGA/PLA網狀支架中形成含有膠原、GAG、纖維粘連蛋白和各種生長因子的真皮基質,最大程度地仿生模擬真皮組織再生的三維空間結構[7,9]。臨床實驗顯示,應用Dermagraft 治療慢性糖尿病患者足部潰瘍的愈合速度明顯快于傳統的覆蓋物。

既有表皮又有真皮的全層組織工程化皮膚由Bell等[10]研究成功,在其工作的基礎上,一種名為Apligraf 的全層組織工程皮膚已經被美國食品藥品監督管理局(FDA)批準應用。Apligraf 無論在外形、生物性能以及代謝行為方面都與人體皮膚組織相近,而且由于其表皮層缺少朗格罕氏細胞(Langerhans's Cell),其免疫原性非常弱[11]。目前,Apligraf 在糖尿病致的下肢潰瘍和靜脈性下肢潰瘍[12]、新生兒表皮松懈癥[13]、燒傷創面、皮膚切除導致的缺損等方面得到了廣泛的應用。

近年來,皮膚修復再生材料的研究在我國也逐漸引起人們的重視,國內多家高等院校、科研院所與醫療機構也相繼在組織工程化人工皮膚的研究中進行了卓有成效的探索與嘗試,取得了積極的成果。上海第九人民醫院的曹誼林[14]以PGA為主要材料,復合患者自體細胞,研制了一種組織工程化皮膚。馬建標等[15]以殼聚糖為主要材料,開發了能促進人成纖維細胞生長的海綿狀人工真皮。第四軍醫大學的金巖[16]利用人成纖維細胞和表皮細胞在膠原凝膠中的復合種植,成功構建了一種類Apligraf 的組織工程雙層皮膚替代物。張其清等[17]采用膠原凝膠構建了一種凝膠型人工真皮,胎兒真皮成纖維細胞在凝膠真皮中增殖速度快,活性高,分泌細胞外基質豐富。

原位誘導皮膚再生材料的研究進展

由于組織工程化皮膚存在種子細胞來源、免疫源性以及儲存、運輸等困難,至今仍未獲得大規模的應用。近年來,隨著再生醫學的發展,原位誘導再生的思想逐步得到認同和重視。皮膚的原位誘導再生是指不添加任何細胞,僅憑材料自身的特性(如孔結構、化學組成、特異性蛋白位點以及活性信號等)達到原位誘導創面細胞及血管長入、分泌細胞外基質、重構皮膚的結構和功能的目的,實現皮膚再生。

最早的皮膚誘導再生材料是由Burke和Yannas等在上世紀80年代初研制成功,并于1996年成為商品化的產品——Integra (Integra Life Sciences)[18]。Integra 由兩層結構組成,其真皮部分主要是由戊二醛交聯的膠原/6-硫酸軟骨素共沉淀物構建的三維多孔支架組成,通過多孔支架引導創面區成纖維細胞的長入和細胞外基質的分泌來形成血管化的再生真皮組織(圖2)。臨床應用的結果顯示,Integra 誘導再生的真皮組織具有典型的乳突狀結構和網狀結構,而且愈合創面無疤痕組織增生[19]。該產品于1996年獲得了FDA臨床使用的許可,歐洲和加拿大等國家和地區的衛生部門也在同年批準該產品可臨床使用。

圖2 Integra的大體形貌(a)和結構特征(b)Fig.2 Macroscopic shape(a)and micro structure(b)of the Integra

Integra因不含活細胞,貯存、運輸簡單,無傳染疾病的風險。一般認為[20-21],Integra在體內起了一個再生模板的作用,其獨特的孔徑結構和組成限制成纖維細胞向肌成纖維細胞分化,從而抑制瘢痕創面形成。其中,GAG成分可降低膠原免疫原性,減輕炎性反應促進血管化形成。也有學者認為,Integra通過預先減輕和阻斷炎性愈合過程而達到再生愈合過程。

Alloderm是一種商品化的脫細胞真皮基質,也具有原位再生皮膚缺損的功能,Kopp[22]經過對67例燒傷患者多中心對照實驗證實,該產品的應用效果相當于薄的自體韌厚移植物加上異體真皮基質或是相當于單獨移植自體韌厚皮片。Callcut[23]認為Alloderm具有可立即使用、易消毒和儲存、成活率高等優點。

我國在皮膚誘導再生材料領域已開展多年的研究,但是目前多數仍處于實驗研發階段,尚無商業化產品。浙江大學高長有、馬列[24-25]等通過對皮膚雙層結構的仿生模擬,研制了一種膠原-殼聚糖/硅橡膠皮膚再生材料(圖3)。該皮膚誘導再生材料的多孔支架層以細胞外基質(ECM)主要成分——膠原為原料,同時添加具有良好抗菌、促進傷口愈合以及促進上皮細胞生長性能的天然生物材料——殼聚糖,起到誘導真皮再生的作用。硅橡膠層則作為臨時表皮層起到隔離外界環境、避免細菌侵入及防止水分蒸發的作用。該皮膚誘導再生材料具有原位使用、原位誘導、避免種子細胞使用的局限性和安全隱患等特點。

圖3 膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層支架的宏觀形貌(a)和顯微結構(b)Fig.3 Macroscopic morphology(a)and micro structure(b)of collagen-chitosan/silicone-rubber bilayer scaffold

該皮膚誘導再生材料在細胞毒性、致敏性、刺激性、熱原性、溶血率、遺傳毒性以及亞慢性毒性等7個指標均達到國家三類醫療器械的標準,具有良好的生物安全性。以巴馬小型豬為動物模型,評價了該材料的原位誘導皮膚再生性能。結果顯示,再生材料不引起明顯炎癥反應,移植7 d后即可觀察皮膚成纖維細胞的誘導長入。28 d后可見大量成纖維細胞長入和血管生成,能有效降低創面肉芽組織增生。移植成功率達94%,證明所研究的材料能有效誘導真皮的再生,控制攣縮,提高創面愈合速度,增加創面愈合后皮膚的彈性、柔軟性及機械耐磨性,降低疤痕組織的形成。真皮再生后移植表皮,發現2周后表皮也成活了,從而實現了全厚皮缺損修復(圖4)。

圖4 皮膚誘導再生材料修復全厚皮缺損的組織切片圖:(a)真皮再生材料移植2周后的組織切片圖,(b)再移植超薄皮片的大體觀察圖,(c)超薄皮片移植2周后的組織切片圖Fig.4 Histological section during full thickness skin loss repaired by skin induced-regereration material:(a)histological section of a collagen-chitosan scaffold after transplantation for2 weekson pig skin,(b)gross view of the wound during the ultra-thin grafting,and(c)histological section of after ultra-thin derma grafting for 2 weeks

蘇州大學李明忠、白倫等以蠶絲蛋白為材料[26-27],研制了一種蠶絲蛋白皮膚再生材料。該皮膚再生材料由上層(“表皮”層)和下層(“真皮”層)組成,其中“真皮”層是由冷凍干燥法制備的孔徑為30～100μm的再生絲素蛋白多孔材料,“表皮”層是經過改性的合成高分子膜。該蠶絲蛋白皮膚再生材料適用于深度燒傷創面真皮組織的修復重建。移植到真皮缺損創面后,“真皮”層能誘導成纖維細胞、血管內皮細胞等修復細胞長入,引導真皮組織的再生,在真皮形態和功能修復過程中蠶絲蛋白皮膚再生材料的“真皮”層逐步被降解吸收;“表皮”層能防止細菌侵入和體液大量流失,為真皮形態和功能的修復營造良好的環境,同時由于上層具備良好的力學性能,可滿足臨床手術操作和人體正常活動的需要。對蠶絲蛋白皮膚再生材料的生物學性能進行的一系列檢測結果表明,蠶絲蛋白皮膚再生材料無細胞毒性、致敏性、刺激性、抗原性、遺傳毒性及亞慢/亞急性毒性,具有良好的生物相容性。體內實驗證明,該材料與創面組織黏附良好,成纖維細胞、血管內皮細胞等組織修復細胞能夠沿多孔絲素材料孔隙遷入并向內生長,真皮層多孔絲素材料的血管化速度快,炎性細胞浸潤少,新生真皮的組織形態與正常真皮相似。

皮膚原位誘導再生的關鍵科學問題與材料設計

. 原位誘導血管化

皮膚的首要功能是將機體組織與外界環境隔絕,起到保護屏障的作用。當皮膚大面積喪失時,可能導致殘疾以致死亡。創傷修復處理的首要目標是使傷口快速閉合,其次是重建具有功能的、形態結構完善的皮膚組織。傷口愈合是一個復雜的生物過程,包括炎癥、有絲分裂、血管新生、細胞外基質的合成和重塑[28]。一般情況下,皮膚修復過程中,早期植入的皮片主要依靠吸收創面滲出的血漿進行營養,但很快新生的毛細血管就與皮片內原有的血管網溝通,建立移植皮膚賴以成活的血液循環系統。人工構建皮膚誘導再生材料不具備血管化結構,移植后的成活率不如活體皮膚。因此,如何實現皮膚誘導再生材料的快速血管化是決定皮膚誘導再生性能的關鍵。

研究顯示,皮膚組織的修復過程往往是多種細胞協同作用的結果,而細胞的增殖遷移以及細胞外基質分泌等行為需要通過生長因子、激素等活性因子的信號調控來實現。基于再生醫學中“原位誘導再生”思想的新一代皮膚再生材料的功能發揮更是離不開這些“活性誘導因子”。因此,復合各類活性因子的皮膚支架有望克服傳統皮膚再生材料“活性”不足、血管化速度慢的缺點。需要指出的是,這些活性因子除了上面所提的生長因子和激素外,還包括活性多肽序列以及具有編碼特定蛋白質功能的基因。

3.1.1 偶聯活性多肽

活性多肽通常指的是包含在細胞外基質組分中的特定多肽序列。這些序列往往能與細胞膜表面某些糖蛋白受體發生特異性作用,調控細胞的黏附、生長、遷移等行為。大量研究工作致力于活性多肽雜化表面的構建以及活性多肽復合支架的制備,并考察其對皮膚修復過程相關細胞的影響。

RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)多肽已被證明是增進細胞黏附的有效配體。Olbrich等[29]發現成纖維細胞在含有RGD的玻璃表面的黏附率提高,但遷移速度下降。這對于活性多肽復合支架的設計有所啟發,因為皮膚組織的修復往往需要成纖維細胞向支架內部的大量遷移侵入。材料表面的RGD密度是影響細胞遷移行為的重要因素。目前在材料中引入RGD序列的常用方法有兩種:①在材料表面固定RGD多肽序列;②人工合成含RGD支鏈的聚合物。

有研究發現,培養基質中的蠶絲蛋白組分有促進成纖維細胞增殖的作用。Hiromi Yamada等[30]采用胰酶消化、色譜分離、氨基酸測序的實驗方法證明:蠶絲蛋白中具有生物活性的區域是重鏈靠近N端的兩個多肽序列V ITTDSDGNE和N INDFDED。這兩種多肽序列在促進細胞增殖方面具有協同作用。因此,人工合成的這兩種多肽可作為活性位點整合到皮膚再生材料中,賦予材料更好的修復與再生性能。

3.1.2 復合生長因子

生長因子是一類與細胞行為有關的信號物質。皮膚再生過程的血管化、膠原基質分泌以及表皮層的重建等過程都與生長因子的種類、分泌量及其分布有關。將生長因子及其載體系統與皮膚支架相結合的研究思想已被眾多科學家所認可,近來涌現出諸多報道。所涉及的因子種類包括:堿性(酸性)成纖維細胞生長因子(bFGF(aFGF))、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、血小板源性生長因子(PDGF)以及轉化生長因子TGF-β等;負載方法包括物理吸附、化學固定、微載體復合等。微載體的引入是為了克服生長因子易失活、在體內半衰期短的不足,載體體系可以實現對生長因子的保護并滿足特定部位對因子劑量和作用時間的需求。

bFGF是體內有效的血管形成因子之一,它對于新生血管形成過程中的多個環節如毛細血管基底膜降解、內皮細胞遷移增生、膠原合成、小血管腔形成等均有明顯促進作用,對于感染傷口、燒傷創面等的治療有著重要的作用。Katsuya Kawai等[31]以乳液法制得平均粒徑為40μm的多孔明膠微球,bFGF灌注吸附在明膠微球中。復合bFGF的明膠微球懸液注射到商品化的膠原真皮支架中(圖5)。進一步體內實驗結果證明:微球起到了控釋生長因子的作用,使得bFGF的有效釋放可持續10 d,進而促進了成纖維細胞的增殖和新生血管的形成。韓春茂等利用肝素對血管生成素的特異性結合作用,將血管生成素固定于肝素化改性的膠原/殼聚糖真皮支架上。動物體內埋植實驗顯示,結合了血管生成素的真皮支架能更快地實現血管化(圖6)。

圖5 含明膠微球的人工真皮SEM照片Fig.5 SEMimage of artificial skin having gelatin microspheres

3.1.3 復合功能基因

生長因子雖然具有效果直接、顯著等優點,但是由于生長因子活性半衰期短,穩定性差,在體內易受環境溫度以及各種酶的作用而喪失活性。體內直接使用生長因子還存在劑量難以精確控制、易出現短期局部高劑量釋放,進而引發創面癌變等問題。

近年來,隨著基因治療新技術的發展,將基因治療技術與組織工程技術相結合,通過基因體外或者原位轉染以獲得高活性支架的研究思想已經逐步獲得認可和重視。這一類組織工程支架被稱為基因活性支架(Gene—ActivatedMatrix),是目前組織工程支架研究中的重要發展方向之一。針對皮膚修復與再生的問題,通過將編碼各種活性因子的基因與組織工程皮膚支架復合,利用愈合過程中創面細胞有絲分裂活躍的特點,在移植過程中原位轉染創面細胞,從而原位表達活性因子,可實現對創面修復再生過程的調控。鑒于裸DNA穩定性差,在傳輸過程中易被降解和清除的特點,組織工程中基因治療的關鍵在于設計和制備具有高穩定性和高轉染效率的基因傳遞系統。

JohnW.Tyrone等[32]將表達PDGF-BB的質粒DNA負載到膠原支架上,以兔耳背潰瘍為模型進行研究。研究表明,DNA有效轉染了侵入支架的細胞并表達了PDGF-BB,促進了粒狀組織的形成、創面表皮的生長以及創面的閉合。Angela Kim等[33]采用PDGF質粒與透明質酸溶液混合凍干的方法得到復合DNA的真皮再生支架,并對支架進行了交聯處理。研究表明,DNA從HA支架中的釋放動力學依賴于DNA的負載量以及支架的交聯程度;支架起到了對DNA的保護與控釋作用。質粒有效轉染了細胞并分泌PDGF;PDGF可有效促進人真皮成纖維細胞(HDFs)的增殖。

圖6 肝素接枝真皮支架的血管生成素結合量與濃度的關系(a),肝素化改性(b)和未改性支架(c)的體內血管化性能比較(箭頭表示血管)Fig.6 Relationship between the concentration of angiogenin and its binding capacity on the heparin modified collagen-chitosan scaffold(a),angiogenesis of the heparin modified(b),and unmodified collagen-chitosan(c)scaffolds after embedded for 2 weeks.arrows expressing blood vessels

表皮生長因子(EGF)對于表皮細胞的生長和增殖具有重要意義。它可強力促進表皮細胞增殖,并刺激其分化成熟,從而推動傷口再上皮化;同時還可以促進內皮細胞和成纖維細胞的遷移。Jan Jeroen Vranckx等[34]以商業化的載體lipofectin將編碼人表皮生長因子(hEGF)的質粒轉染到同種異體角阮細胞中并進行體外培養,形成大量表達hEGF的細胞懸液。該細胞懸液作為外源性的hEGF“供應倉庫”直接注射或與支架結合后植入創面。實驗表明,創面修復過程得到有效促進。Chen等[35-36]將可表達PDGF的基因質粒與透明質酸凝膠復合,通過從凝膠中釋放,在創面區原位轉染成纖維細胞,提高了成纖維細胞的PDGF的表達水平,達到促進纖維組織形成,加快血管化和表皮化的目的。

3.1.4 藥物及多種活性因子的協同作用

抗菌藥物可減少創面感染,為皮膚組織的修復提供良好環境。多肽、生長因子、基因等多種活性因子在組織修復與再生過程的各個階段發揮不同的調控作用,并可能呈現協同效應。因此,將藥物及多種因子復合應用到皮膚再生材料中,有望提高皮膚修復與再生的質量。

Katsuko Furukawa等[37]通過多種藥物及外源活性因子的添加(胰島素、氟美松、抗壞血酸、bFGF等),在體外成功構建了具有高成纖維細胞密度的真皮支架,形成了高密度細胞聚集體。PCR實驗表明,若將這類由外源性因子誘導形成的細胞聚集體培養在可降解的聚合物支架中,相比低細胞密度的支架,可表達更高水平的TGF-β3,有利于缺損真皮的修復。

Sung Ran Hong[38]將抗生素Silver sulfadiazine(AgSD)和表皮生長因子EGF共同負載到明膠/透明質酸支架中,以小鼠為動物實驗模型,研究這兩類活性物質的加入對修缺損皮膚創面修復的作用。以單克隆抗體PC10對PCNA進行免疫組化染色,以研究上皮細胞的增殖。研究表明,抗生素和EGF的協同作用可有效降低免疫反應并促進受損皮膚的修復。但是EGF的促表皮生長的活性在一周以后即喪失。因此,一種起到緩釋作用的生長因子載體顯得十分必要。

Heathe Waldeck[39]以RGD修飾Gelatin,同時復合角阮細胞生長因子(KGF),并利用光引發聚合在創面原位形成具有生物活性的IPN支架。小鼠全層皮膚缺損模型研究證明:該活性材料體系在創傷修復早期起到抑制收縮的作用,更好地誘導了細胞外基質重建和新生組織血管化(圖7中NV為新生血管,E為表皮)。

圖7 移植3周后的HE切片圖:(a)RGD修飾的IPN+KGF界面,(b)未改性的明膠IPN界面,(c)傳統敷料界面Fig.7 Photo micrographs of(a)RGD modified IPNtKGF interface,(b)unmodified gelatin IPN interface,and(c)conventional dressing interface(region directed with NV expressing new grown blood vessel,region directed with E expressing epidermis)

. 原位誘導細胞遷移

3.2.1 皮膚創傷修復的過程與機理

皮膚創傷的修復是一個復雜有序、高度協調的過程,每個階段都受到機體精確的調控。目前認為,創傷修復是多種修復細胞和生長因子共同參與,并與細胞外基質相互作用的動態過程。其中,修復細胞包括了成纖維細胞(Fibroblast)、血管內皮細胞(Vascular Endothelium Cell)以及巨噬細胞(Macrophage)、白細胞(Leucocyte)等炎癥細胞[40],而生長因子則有PDGF,TGF-β,EGF、VEGF、bFGF、類胰島素生長因子(IGF)、角質細胞生長因子(KGF)和神經生長因子(NGF)等等[41-42]。

皮膚損傷修復初期,局部發生炎癥反應,血小板和紅細胞數量增加,血栓形成。炎癥部位產生大量的細胞因子,這些因子作為化學趨化劑選擇性地介導中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞先后向炎癥部位遷移,發生區域性聚集,起到吞噬清創、產生蛋白酶、釋放生長因子和抗原加工等作用[43]。

修復的中期(約3 d后),內皮細胞先遷移到受損部位形成新生血管。接著血小板、炎癥細胞和活化了的血管內皮細胞會釋放生長因子,如TGF-β,EGF,FGF和促纖維化細胞因子(如 IL-1和TNF-α)等,這些因子能誘導成纖維細胞逐漸向創傷中心遷移,形成肉芽組織。此外,生長因子還可以通過抑制膠原酶等的活性,減少細胞外基質的降解,促進細胞外基質,如I型膠原、纖維連接蛋白等的大量分泌和合成,填補組織缺損[44]。

創傷愈合最后的過程(約兩周后)是組織改建。成纖維細胞在多種細胞因子的誘導作用下,大量轉換為收縮表型,即肌成纖維細胞(Myofibroblast,MFb),并通過成纖維細胞表面的整合素調節ECM,即通過其偽足的伸出、回縮而收縮其周圍的膠原基質,使傷口發生收縮。另一方面,成纖維細胞通過分泌基質金屬蛋白(MatrixMetalloproteinases,MMPs)及其組織抑制劑(Tissue Inhibitor ofMetalloproteinases,T IMPs)來調控舊膠原的降解和新膠原的重排和沉積[44]。

由創傷修復過程可知,細胞遷移是關系創傷修復效果的關鍵細胞行為之一。因此,賦予材料原位誘導和調控細胞遷移的性能,是實現材料原位誘導皮膚再生的重要途徑。

3.2.2 細胞遷移的運動機理與調控因素

細胞的運動是一個由細胞骨架、細胞膜和信號傳導系統共同參與的相當復雜的過程。通常來講,細胞遷移是一個往復循環的過程,每個周期可以分成細胞前端突出、偽足與基底的粘著、細胞體收縮和前移、細胞尾部釋放四個步驟。

在均勻的環境中,細胞呈現無規行走。而將細胞置于一個不對稱的環境,如化學或物理信號梯度中時,細胞膜和細胞骨架會重新排布,顯示出極化的狀態,細胞的前端與后端差異顯著[45]。在化學引誘劑的濃度梯度中,細胞膜表面的受體出現前多后少的分布狀況,梯度信號因此而被放大并固定在細胞上[46-47]。沿著梯度,細胞與基底配體濃度高的一端結合的更牢,于是在一個細胞長度范圍內,細胞頭尾兩端粘附力的差異驅動著細胞向高濃度一端爬移[48]。這種細胞能夠感知固定在表面的趨化因子的濃度差異而發生遷移的能力稱為趨觸性(hapotaxis)。此外,大量的研究表明,細胞同樣可以響應于物理機械信號梯度而發生遷移,如粗糙度或表面硬度(durotaxis)。隨著基底的模量增加,細胞鋪展得更好,所受牽引力也隨之增大,引導了細胞往模量高的方向遷移。

3.2.3 梯度表面的設計

梯度材料是指材料的化學組成、物理結構或拓撲形貌在空間上發生連續變化的一種材料。在皮膚損傷修復過程中,血小板和巨噬細胞釋放的PDGF在組織中形成濃度梯度,作為化學引誘劑和促有絲分裂劑誘導真皮成纖維細胞侵入創口的纖維蛋白凝塊中并大量增殖[49-50]。梯度材料將誘導因子以共價鍵形式梯度固定于皮膚再生材料表面,從而達到在體外模擬生物體細胞微環境的目的,實現成纖維細胞、內皮細胞的原位誘導遷移和皮膚組織的再生。

(1)化學信號梯度

再生醫學中的化學信號梯度材料通常是指材料表面所固定的生物大分子的濃度的梯度,包括細胞外基質蛋白、各類生長因子和活性多肽,如RGD。細胞通過細胞膜表面的αvβ1整合素與基底所固定的配體特異性結合,感受到這種濃度的變化,并引發一系列的信號傳導途徑而發生遷移。

RGD濃度梯度 眾所周知,RGD序列是增進細胞粘連的有效配體,因而可在生物材料表面引入RGD序列。引入RGD序列的方法常可分為兩類:①在材料表面直接固定RGD肽序列[51-53];②形成聚合物-RGD肽鏈雜化分子[54-56]。Catherine用程序控制的注射泵將丙烯酸溶液和丙烯酸-RGD溶液以設定的比例梯度混合,注入石英器皿,紫外光交聯得到RGD濃度梯度水凝膠。在這種梯度表面種植成纖維細胞,細胞定向規整排列,80%的細胞與梯度方向的夾角小于20°。而在RGD的均勻表面上,細胞在各個方向上的無規排列[55]。Solitaire在PEG-RGD的濃度呈梯度變化的PEG水凝膠表面也觀察到了同樣的結果。人真皮成纖維細胞沿著梯度方向排列,且隨著培養時間增長,細胞的取向更加規整。更為重要的結果是在RGD梯度表面,細胞的沿著梯度向濃度高的一端遷移的距離遠大于均勻表面[56](圖8)。

圖8 梯度RGD水凝膠的制備示意圖(a),RGD均一水凝膠表面的成纖維細胞(b),梯度水凝膠內取向的成纖維細胞(c)Fig.8 Gradient hydrogelswere formed using a gradientmaker as depicted above in combination with a peristaltic pump(a),More fibroblasts were aligned on hydrogel surfaceswith a 0-1 gradient of tethered RGD(indicated by arrow)(c)than on hydrogel surfacescontaining RGD at a constant concentration(b)

細胞外基質濃度梯度 細胞膜表面存在著一種跨膜糖蛋白—α β整合素,可以識別細胞外基質成分并與之結合。整合素有很多種類,可以與不同的配體特異性結合。ECM中的蛋白質就是通過整合素連接到細胞內骨架蛋白如肌動蛋白等,并將信息傳導到細胞內,調控細胞的行為[57-59]。纖維粘連蛋白中含有RGD的位點,能與細胞膜表面的整合素α5β1和α4β1結合[60],而膠原能與α2β1結合[61],從而介導細胞的遷移。Rico等人用微流體通道產生層粘連蛋白的濃度梯度表面[62],以及層粘連蛋白(LN)和I型膠原的復合梯度[63]。對于內皮細胞而言,提高LN的濃度并不一定能增加細胞的運動性,而是在適中的濃度時達到最大的遷移速率。因為,LN濃度低時,細胞錨著的位點少,得不到足夠大的牽引力。但是當表面LN密度高的時候,細胞鋪展良好,前端與后端的錨著力沒有明顯差異,細胞的運動也就失去了方向性。另一方面,提高梯度的變化斜率,對內皮細胞的遷移速率也沒有明顯的影響。

生長因子濃度梯度 迄今為止,很多的研究表明,以共價鍵形式固定于材料上的生長因子仍能夠保持較高的活性[64-65]。常用的生長因子有表皮生長因子(EGF)[64,66],成纖維生長因子(FGF)[67]和血管內皮生長因子(VEGF)[68]等。以EGF為例,EGF可以誘導非遷移性的細胞轉化為遷移性細胞,甚至可以激活某些整合素來促進遷移。如癌細胞表面的整合素αvβ5只能介導細胞的粘附而不參與細胞在玻纖蛋白上的遷移,但是通過EFG的激活,細胞不但可以在玻纖蛋白上進行遷移,而且其在膠原基質上的運動性不受影響。Liu[68]等人利用電解法,即通過金的氧化還原控制硫醇的吸附和脫附,產生硫醇的濃度梯度。利用羧基固定纖連蛋白或VEGF。然后在產生的FN、VEGF以及兩者的復合梯度表面種植牛動脈內皮細胞,24h后結果表明無論是纖連蛋白還是VEGF,或是兩者結合的梯度表面,細胞的運動性均要強于均勻表面。細胞在VEGF的梯度表面比在FN梯度表面運動性增加了兩倍,而在兩者結合的梯度表面比在VEGF的梯度表面細胞運動性又增加了兩倍。

(2)物理機械信號梯度

調控細胞響應的生物材料界面的研究集中于表面化學和拓撲圖案。直到最近幾年,科學家們的研究發現材料表面的機械性能——模量也能影響細胞的行為[69-71]。制備模量梯度材料最直接的方法就是控制不同位置的交聯密度,因此,從化學組成來講,它實質上是指交聯劑的濃度梯度。而目前絕大部分的表面模量梯度都是選用聚丙烯酰胺(PAAM)為基底,雙官能度的丙烯酰胺為交聯劑。

Nadia等人采用微流體技術產生雙官能度的丙烯酰胺濃度梯度溶液,在紫外光照射下原位交聯成凝膠,得到模量梯度材料[69]。在材料表面接枝一層I型膠原后種植血管平滑肌細胞,發現細胞在硬度高的區域鋪展良好,而在軟的區域,細胞形態更接近圓形。用高分辨率顯微鏡觀察,發現細胞骨架亦存在差異,前者細胞內的F-肌動蛋白微絲結構精細,而后者的細胞骨架雜亂無章排列。因此,細胞的粘附行為受表面模量的調控,更趨向于在硬的區域粘附,其數量也從硬的一端向軟的一端逐漸減少。Chun-Min Lo等制備了一種兩段式的表面,在軟、硬的交界處有一段50～100μm寬的梯度過渡區域。在其上培養3T3成纖維細胞15 h后,用顯微鏡記錄細胞運動。若細胞最初種于軟端,則能夠沿著梯度穿越邊界而到達硬端,但是,如果細胞最初處于硬的一端,細胞則會停留在硬端,無法穿越邊界到達軟端(圖9)。

圖9 3T3成纖維細胞在硬度梯度表面的遷移:(a)細胞種在軟的一端,最終穿越邊界進入硬端;(b)細胞種在硬端,最終無法穿越梯度邊界Fig.9 Movements ofNational InstitutesofHealth 3T3 cellson substrateswith a rigidity gradient:(a)a cellmoved from the soft side of the substrate toward the gradient and(b)a cell can notmove from the stiff side of the substrate toward the gradient

皮膚再生材料存在的問題與展望

目前,皮膚原位誘導再生材料只能實現真皮組織的誘導再生,無法實現表皮層和真皮層同時的誘導再生,更缺少正常皮膚所具有的毛囊、汗腺、皮脂腺、神經以及黑色素細胞等附屬成分。近年來,應用組織工程技術構建含有附屬器官的皮膚正成為研究熱點。Wu等將真皮毛囊鞘成纖維細胞種植于膠原凝膠,成功誘導再生出類毛囊結構[72]。Tai-Horng Young[73]等通過真皮乳頭細胞(dermal papilla cells)自聚集的方法,在poly(ethyleneco-vinyl alcohol)膜上成功制備了類球體的微組織(圖10),體內試驗發現該微組織可在一定程度上誘導毛囊的再生(圖10)。Berthod等在膠原/殼聚糖多孔支架中添加層粘連蛋白(Laminin),復合種植成纖維細胞和角質細胞,移植于裸鼠背部,120 d后發現,添加了層粘連蛋白的支架中,新生神經的數量是對照組的7倍[74]。Neil等在經化學改性的材料表面實現了黑色素細胞和皮膚角質細胞的共培養,可望在修復皮膚缺損的同時,解決色素缺乏的問題[75]。金巖等以包皮組織作為細胞源,采用消化法獲得角朊細胞、成纖維細胞和黑色素細胞,采用自行設計的組織工程皮膚培養系統,構建了含黑色素細胞的組織工程皮膚。實驗結果表明,所構建的組織工程皮膚結構完整,層次清晰,表皮細胞和成纖維細胞活力良好[76]。

圖10 體外制備的類毛囊體以及該類毛囊體在體內實驗中的組織觀察Fig.10 Morphology of the dermal papilla microtissue(a)andhistology of induced hair follicle in the patch assay(b)

是否能夠通過原位誘導再生的方法,實現具有全結構和全功能的皮膚組織的再生?皮膚原位誘導再生材料可能具有同時誘導、調控多種細胞行為的性能嗎?生命體通過干細胞分裂來實現細胞的更新及保證持續生長。隨著干細胞研究尤其是成體干細胞研究的快速發展,干細胞為采用組織工程技術構建人體組織、器官提供充足可靠的細胞來源已成為可能,這也將成為干細胞應用的一個主要方向。

Hu Kuikui[77]等將表皮干細胞(epidermal stem cells)復合的皮膚支架進行體內移植研究,發現復合了表皮干細胞的皮膚支架可促進皮膚缺損修復,并減少瘢痕的形成。Christelle Coraux等[78]證明胚胎干細胞可在體外分化為角質細胞,并發現復合了胚胎干細胞的皮膚支架能發展出與真正皮膚非常相近的結構。Qi Shaohai等[79]制備了復合有異種真皮、表皮干細胞和真皮毛乳頭細胞的組織工程皮膚,發現該組織工程皮膚可得到更厚的表皮,并可以減少瘢痕的產生。Elaine F.Kung等[80],將人的內皮祖細胞與組織工程皮膚支架相復合,獲得了可誘導微管再生的組織工程皮膚(圖11)。

圖11 未復合(a)與復合(b)內皮祖細胞的組織工程皮膚的組織分析Fig.11 Histological evaluation of human skin substitutes(HSSs)seeded with EPCs(b)after 2 weeks in vivo(×200).The HSSswithout seeding was used as a control(a)

此外,已有研究發現,干細胞復合可以實現附屬器官的再生。Ju Linxie等[81]將制備一種復合表皮干細胞和成纖維細胞的組織工程皮膚。經移植試驗發現,該組織工程皮膚可誘導生成與完整皮膚在形態學上非常相近真皮和表皮。YiLin等[82]將由ES分化而來的表皮干細胞與組織工程皮膚支架相復合,移植于老鼠后,發現此組織工程皮膚可誘導生成類毛囊結構與腺狀結構。

因此,結合干細胞技術和原位誘導再生思想,原位誘導皮膚再生材料未來發展的方向是:通過調節材料的微結構、仿生組成、表面特異性位點以及活性信息的復合等手段,賦予材料原位動員、原位捕獲、誘導遷移以及分化調控特定干細胞的性能,仿生構建干細胞體內分化的微環境,誘導干細胞的定向分化,實現具有全結構和功能的皮膚組織的原位誘導再生。

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Progress and Challenge of Skin Induced-Regeneration Materials

MA Lie1,GAO Changyou1,LI Mingzhong2,BAI Lun2,SHEN Jiacong1

(1.MOE Key Laboratory of Macromolecular Synthesis and Functionalization,Department of Polymer Science and Engineering,Zhejiang University,Hangzhou 310027,China)
(2.National Engineering Laboratory for Modern Silk,Soochow University,Suzhou 215021,China)

Skin defect is one of the serious surgical problems.The research background and history of skin regenerating materials are summarized in this review.Particularly,the recent progress in skin induced-regeneration materials is introduced.Angio genesis and cell migration are emphasized as the key issues determining the resultof skin regeneration.Finally,the possible breakthrough in future is envisaged by analyzing the challenges remained in the skin induced-regeneration materials.

biomedical materials;skin defect;induced-regeneration;angio genesis;cell migration

R318.08

A

1674-3962(2010)09-0034-12

2008-12-01

國家973計劃項目(2005CB623902);浙江省科技計劃重點項目資助(2007C23014)

高長有,男,1966年生,教授