酪蛋白水解物對瑞士乳桿菌生長的影響

胡志和，區(qū)翠顏，朱利民，馮永強，張建軍

(1.天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134；2.天津海河乳業(yè)有限公司，天津 300402)

酪蛋白水解物對瑞士乳桿菌生長的影響

胡志和1，區(qū)翠顏1，朱利民2，馮永強2，張建軍2

(1.天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134；2.天津海河乳業(yè)有限公司，天津 300402)

利用胰蛋白酶水解酪蛋白，以水解物對瑞士乳桿菌增殖效果為指標(biāo)，優(yōu)化水解條件，并研究最佳增殖效果。 結(jié)果表明：胰蛋白酶水解酪蛋白的最佳水解條件為水解溫度37℃、底物質(zhì)量分數(shù)5%、酶與底物質(zhì)量比1:600、pH8.0，此條件下制備的水解產(chǎn)物添加量為1g/100mL時對瑞士乳桿菌生長增殖效果最好，而添加量大于4g/100mL時，對瑞士乳桿菌生長呈現(xiàn)抑制作用。

胰蛋白酶；酪蛋白水解物；瑞士乳桿菌；增殖

牛乳酪蛋白中蘊藏著許多具有生物活性的多肽，如阿片活性、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性、免疫調(diào)節(jié)活性、結(jié)合礦物質(zhì)、抗血栓活性、抑菌活性、促進雙歧桿菌活性和抗氧化活性等，這些多肽可通過體內(nèi)和體外的酶水解釋放出來[1-6]。近幾年來，有關(guān)添加蛋白水解物對發(fā)酵乳中益生菌生長影響的研究均有相關(guān)報道，張蓉真等[7]報道了大豆水解蛋白對乳酸菌增殖的促進作用；趙新淮等[8]研究了大豆蛋白水解物的乳酸發(fā)酵促進作用；呂嘉櫪等[9]指出，添加肽或氨基酸等微量營養(yǎng)物質(zhì)可以提高乳制品中益生菌的活菌數(shù)。

本研究利用胰蛋白酶水解酪蛋白制備酪蛋白水解物，并以水解產(chǎn)物對瑞士乳桿菌增殖情況為指標(biāo)，確定水解條件。同時，在培養(yǎng)基中添加不同量的水解物培養(yǎng)瑞士乳桿菌，確定適合其生長的添加量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白(酪蛋白含量≥80%)、乳清粉(蛋白含量≥80%) 天津海河乳業(yè)有限公司。

胰蛋白酶(10000U/g) Sigma公司；瑞士乳桿菌(6024)天津商業(yè)大學(xué)微生物實驗室；酵母膏(生化試劑) 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蛋白胨(生化試劑) 天津市福晨化學(xué)試劑廠；牛肉膏(生化試劑) 天津市英博生化試劑有限公司；葡萄糖、無水乙酸鈉、MgSO4·7H2O、K2HPO4(均為分析純) 天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司；檸檬酸氫二銨(分析純) 天津石英鐘廠霸州市化工分廠；吐溫-80(化學(xué)純) 天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；瓊脂(生化試劑) 日本Oxoid公司；溴甲酚綠(分析純) 天津市薊縣長城化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS24電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；RW20.n攪拌器 德國IKA公司；Scientz-50N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；Q2-901漩渦振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造公司；L535-1臺式低速離心機 湘儀離心機儀器有限公司；HVE-50高壓滅菌器 Hirayama公司；DPX-9082B-1電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海福瑪實驗設(shè)備有限公司；UV-2100紫外-可見分光光度計日本Unico公司。

1.3 方法

1.3.1 瑞士乳桿菌菌液濃度與OD值工作關(guān)系曲線制作[10]

1.3.1.1 培養(yǎng)基的制備

1)乳清液的制備：120g乳清粉溶解于1000mL水中，112℃滅菌20min，過濾取清液即為乳清液。2)MRS為基礎(chǔ)的改良培養(yǎng)基[11](1號培養(yǎng)基)：酵母膏5g、蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、葡萄糖20g、無水乙酸鈉5g、檸檬酸氫二銨2g、吐溫-80 1mL、MgSO4·7H2O 0.58g、K2HPO42g、乳清液100mL，調(diào)pH6.4，121℃滅菌20min。3)計數(shù)培養(yǎng)基：A液：120g乳清粉溶解于1000mL水中，112℃滅菌20min，過濾取清液；B液：0.5%葡萄糖，1%酵母膏，調(diào)pH7.4，加3.6%瓊脂和0.16%的溴甲酚綠。將A、B液按體積比1:1混合，115℃滅菌20min即為計數(shù)培養(yǎng)基。4)瓊脂培養(yǎng)基：1.2%的瓊脂溶液。

1.3.1.2 瑞士乳桿菌菌液濃度與OD值工作關(guān)系曲線的制作

按體積分數(shù)3%的接種量，向裝有10mL滅菌MRS的改良培養(yǎng)基中接入0.3mL菌液，迅速搖勻后，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

對培養(yǎng)24h后的菌液進行系列稀釋，稀釋液為MRS為基礎(chǔ)的改良培養(yǎng)基，在600nm波長處測定每個稀釋度的OD值，并采用平板計數(shù)法檢測各稀釋度的菌落數(shù)。具體方法為：取5個稀釋度樣品，再分別稀釋至10-4、10-5、10-6，取菌液0.1mL于計數(shù)培養(yǎng)基內(nèi)進行涂布，涂布均勻后加上一層瓊脂培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)4d，進行菌落計數(shù)。

1.3.2 單因素條件下胰蛋白酶水解酪蛋白的產(chǎn)物對瑞士乳桿菌生長的影響

1.3.2.1 酪蛋白水解物的制備

(1)胰蛋白酶水解酪蛋白單因素條件

溫度的單因素試驗：pH8.0、底物質(zhì)量分數(shù)4%、酶與底物質(zhì)量比1:200，溫度分別取35、40、45、50、55℃進行水解。酶與底物質(zhì)量的單因素試驗：pH8.0、溫度45℃、底物質(zhì)量分數(shù)比4%，酶與底物質(zhì)量比分別為1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600進行水解。底物質(zhì)量分數(shù)的單因素試驗：pH8.0、溫度45℃，酶與底物質(zhì)量比1:200，底物質(zhì)量分數(shù)分別為2%、4%、6%、8%、10%進行水解。

(2)酪蛋白水解物的制備[12]

根據(jù)上述各單因素的試驗條件，稱取一定量的酪蛋白，邊攪拌邊緩慢加入至500mL去離子水中溶解，放入恒溫水浴中，并保持適當(dāng)溫度，用1mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至8.0，加入胰蛋白酶液，開始計時，檢測pH值變化并使用1mol/L NaOH溶液維持體系pH8.0，記錄NaOH溶液的添加體積，水解至平衡，用HCl溶液調(diào)至pH7.0，沸水浴滅酶15min；4000r/min離心20min，上清液冷凍干燥得酪蛋白水解產(chǎn)物。考察各單因素變化對水解度的影響。

(3) pH-Stat法計算酪蛋白水解度[13]

水解度DH/%=V×c×1/α×1/mp×1/h×100

式中：V為水解過程中消耗的NaOH溶液體積/mL；c為NaOH 的濃度/(mol/L)；mp為蛋白質(zhì)總質(zhì)量/g；α為α-氨基酸的解離度，對于酪蛋白，1/α=2.26；h為每克蛋白質(zhì)中肽鍵的毫摩爾數(shù)/(mmol)，對于酪蛋白取8.2。

1.3.2.2 各單因素條件下制備的水解產(chǎn)物對瑞士乳桿菌生長的影響

(1)酪蛋白水解物的適宜添加量確定

選在pH8.0、溫度45℃、底物質(zhì)量分數(shù)4%、酶與底物質(zhì)量比為1:200的水解條件下得出的酪蛋白水解物為實驗用材料，按水解物添加質(zhì)量濃度為0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4g/100mL的添加量，分別加入到1號改良培養(yǎng)基中，接菌量為3%，37℃恒溫培養(yǎng)24h后，對菌液分別做5倍稀釋后測OD600nm，空白為1號培養(yǎng)基；根據(jù)工作關(guān)系曲線計算出瑞士乳桿菌菌濃度。

(2)各單因素條件下制備水解產(chǎn)物對瑞士乳桿菌的影響

按上述所確定的添加量，將方法1.3.2.1節(jié)中各條件下制備的水解產(chǎn)物加入1號培養(yǎng)基，然后接入瑞士乳桿菌，接種量為3%，37℃恒溫培養(yǎng)24h，5倍稀釋后測OD600nm，空白為1號培養(yǎng)基，根據(jù)工作關(guān)系曲線計算出瑞士乳桿菌菌濃度。根據(jù)各單因素條件下制備的水解產(chǎn)物對乳酸菌生長的影響程度，確定各單因素水解條件的范圍。

1.3.3 胰蛋白酶水解酪蛋白條件的優(yōu)化

1.3.3.1 水解條件的優(yōu)化

根據(jù)水解產(chǎn)物對瑞士乳桿菌生長的影響，優(yōu)化胰蛋白酶的水解條件，選取三因素三水平進行正交試驗，因素及水平見表1。

表1 胰蛋白酶水解酪蛋白的正交試驗條件Table 1 Orthogonal experiment condition of casein hydrolysate by trypsin

1.3.3.2 優(yōu)化條件下制備的水解產(chǎn)物對瑞士乳桿菌生長的影響

根據(jù)方法1.3.3.1節(jié)優(yōu)化的水解條件，制備水解產(chǎn)物，并以0、1、2、3、4、6、8、10 g/10 0mL的質(zhì)量濃度制備培養(yǎng)基，觀察水解物在不同添加量時對瑞士乳桿菌生長的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 瑞士乳桿菌菌濃度與OD600nm值關(guān)系曲線

由圖1可知，瑞士乳桿菌菌濃度增大，光密度增加，并呈線性關(guān)系，通過線性回歸分析可得回歸方程：y=0.8137x+0.018(R2=0.991)。

2.2 單因素條件下胰蛋白酶水解酪蛋的產(chǎn)物對瑞士乳桿菌生長的影響

2.2.1 底物質(zhì)量分數(shù)對酪蛋白水解進程及水解度的影響

圖2 不同底物質(zhì)量分數(shù)的酪蛋白水解進程曲線Fig.2 Hydrolysis process of casein hydrolyzed by trypsin at different concentrations of substrate

在pH8.0、溫度45℃、酶與底物質(zhì)量比1:200的條件下，底物質(zhì)量分數(shù)為2%、4%、6%、8%、10%時，酪蛋白水解進程及水解度見圖2、3。

圖3 不同底物質(zhì)量分數(shù)酪蛋白的水解度Fig.3 Degree of casein hydrolysis by trypsin at different concentration of substrate

由圖 2可知，不同底物質(zhì)量分數(shù)條件下水解，在220min時到達平衡。由圖3可知，隨著底物質(zhì)量分數(shù)的增大，酪蛋白水解度降低。

2.2.2 酶與底物比對酪蛋白水解進程及水解度的影響

在pH8.0、溫度45℃、底物質(zhì)量分數(shù)4%的條件下，酶與底物質(zhì)量比分別為1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600。水解酪蛋白的水解進程及水解度見圖4、5。

圖4 不同酶與底物質(zhì)量比酪蛋白的水解進程曲線Fig.4 Hydrolysis process of casein by trypsin at different quality ratios of enzyme to substrate

圖5 不同酶與底物質(zhì)量時酪蛋白的水解度Fig.5 Degree of casein hydrolysis by trypsin at different quality ratio for enzyme to substrate

由圖4可知，整個反應(yīng)體系在210min時達到平衡。由圖5可知，酶與底物之比越小，水解程度越低。

2.2.3 溫度對酪蛋白水解進程及水解度的影響

在p H 8.0，底物質(zhì)量分數(shù)4%、酶與底物質(zhì)量比1:2 0 0的條件下，水解溫度分別取3 5、4 0、4 5、5 0、5 5℃，水解酪蛋白的進程曲線及水解度見圖 6、7。

圖6 不同溫度酪蛋白的水解進程曲線Fig.6 Hydrolysis process of casein by trypsin at different temperatures

圖7 不同溫度酪蛋白的水解度Fig.7 Degree of casein hydrolysis by trypsin at different temperatures

由圖6可知，在所選擇的溫度范圍內(nèi)，不同溫度條件下反應(yīng)，在210min時整個反應(yīng)體系達到平衡。由圖7可知，水解溫度在50℃時，水解效果較好。

2.2.4 單因素條件下制備酪蛋白水解物添加量對瑞士乳桿菌生長的影響

2.2.4.1 水解物添加量的確定

選在pH8.0、溫度45℃、底物質(zhì)量分數(shù)4%、酶與底物質(zhì)量比為1:200的水解條件下得出的酪蛋白水解物為實驗材料，在培養(yǎng)基中添加0～0.4g/10mL的水解物，其對瑞士乳桿菌生長影響結(jié)果見圖8。

由圖8可知，在酪蛋白水解物添加量的范圍為0～0.1g/10mL時，隨著添加量的增大，對瑞士乳桿菌生長的促進作用逐漸增大；0.1g/10mL時達到最高點；添加量大于0.1g/10mL時，這種促進作用逐漸減小；添加量為0.4g/10mL時，出現(xiàn)抑制作用。

圖8 不同酪蛋白水解物添加量對瑞士乳桿菌生長的影響Fig.8 Effect of addition quality on promoting the growth of Lactobacillus helvectucus

2.2.4.2 各單因素條件下胰蛋白酶水解酪蛋白產(chǎn)物對瑞士乳桿菌生長的影響

將各單因素條件下所獲得的水解產(chǎn)物按照0.1g/10mL的量添加到1號培養(yǎng)基中，接種瑞士乳桿菌進行培養(yǎng)，其影響見圖9～11。

圖9 不同底物質(zhì)量分數(shù)酪蛋白水解物對瑞士乳桿菌生長的影響Fig.9 Effect of casein hydrolysate at different substrate concentrations on growth of Lactobacillus helvectucus

圖10 不同酶與底物質(zhì)量比酪蛋白的水解物對瑞士乳桿菌生長的影響Fig.10 Effect of casein hydrolysate at different quality ratios of enzyme to substrate on growth of Lactobacillus helvectucus

圖11 不同溫度酪蛋白的水解度對瑞士乳桿菌生長的影響Fig.11 Effect of casein hydrolysate at different temperatures on growth of Lactobacillus helvectucus

由圖9～11可知，較適宜的底物質(zhì)量分數(shù)為4%～6%，酶與底物質(zhì)量比1:200～1:800，溫度為35～45℃，在上述條件下獲得的水解物對瑞士乳桿菌生長均有較好的促進作用，并確定了正交試驗各因素的水平范圍。另外，與圖3、圖5和圖7結(jié)果比較可知，水解度大的水解產(chǎn)物對瑞士乳桿菌生長的促進作用并非最強。

2.3 酪蛋白水解條件優(yōu)化

2.3.1 正交試驗各條件下水解產(chǎn)物對瑞士乳桿菌增殖的影響

表2 正交試驗條件下酪蛋白水解產(chǎn)物對瑞士乳桿菌生長的影響Table 2 Orthogonal experiment on the effect of casein hydrolysate on promoting the growth of Lactobacillus helvectucus

由表 2可知，3種因素(水解條件)對瑞士乳桿菌生長影響的大小依次為A＞B＞C，即底物質(zhì)量分數(shù)＞酶與底物質(zhì)量比＞溫度，最好的實驗方案為A1B3C1，即水解溫度37℃、底物質(zhì)量分數(shù)5%、酶與底物質(zhì)量比1:600，pH8.0，此條件下得出的水解產(chǎn)物對瑞士乳桿菌生長增殖效果最好，菌濃度為2.484×108CFU/mL。

2.3.2 正交試驗條件下水解產(chǎn)物的制備

根據(jù)正交試驗條件制備水解產(chǎn)物，各條件下水解進程曲線見圖12，水解度見圖13。

圖12 正交試驗條件下胰蛋白酶水解酪蛋白水解進程曲線Fig.12 Hydrolysis process of casein hydrolysed by trypsin under orthogonal experiment condition

圖13 正交試驗條件下胰蛋白酶水解酪蛋白的水解產(chǎn)物的水解度Fig.13 Orthogonal experiment condition for the degree of casein hydrolysis by trypsin

由圖12、13可知，各條件下制備水解產(chǎn)物的時間為210min，樣品1、5、9的水解度較大。但由表2可知，樣品1、5、9雖然水解度較大，但其對瑞士乳桿菌生長的促時作用并非最強。

2.3.3 優(yōu)化條件下制備的酪蛋白水解物對瑞士乳桿菌生長的影響

根據(jù)優(yōu)化水解條件制備酪蛋白水解物，添加量梯度為0、1、2、4、6、8、10g/100mL制作培養(yǎng)基，觀察其對瑞士乳桿菌生長的影響，結(jié)果見圖14。

圖14 不同質(zhì)量濃度酪蛋白水解物對瑞士乳桿菌生長的影響Fig.14 Effect of different concentrations of casein hydrolysate on promoting the growth of Lactobacillus helvectucus

由圖14可知，1g/100mL的酪蛋白水解物為最適添加量；當(dāng)添加質(zhì)量濃度范圍在2～4g/100mL時，促進作用逐漸減緩，當(dāng)添加質(zhì)量濃度超過4g/100mL時，開始呈現(xiàn)抑制瑞士乳桿菌生長的趨勢。

3 結(jié) 論

通過上述研究可知，胰蛋白酶水解酪蛋白的水解產(chǎn)物添加量≤1g/100mL，對瑞士乳桿菌具有一定的增殖作用；添加量＞1g/100mL時，對其增殖促進作用減弱；當(dāng)添加量＞4g/100mL時，酪蛋白水解物則呈現(xiàn)抑制其生長的作用。另外，水解度大的水解產(chǎn)物對瑞士乳桿菌的生長促進作用并非最強。

[1] SILVA S V, MALCATA F X. Caseins as source of bioactive peptides[J].International Dairy Journal, 2005, 15(1): 1-15.

[2] HATA I, UEDA J, OTANI H. Immunostimulatory action of acommercially available casein phosphopeptide preparation, CPPIII, in cell cultures[J].Milchwissenschaft, 1999, 54(1): 3-7.

[3] JOLLES P, PARKER F, FLOCH F, et al. Immunostimulating substances from humancasein[J]. Journal of Immunopharmacology, 1981,3: 363-369.

[4] KAYSER H, MEISEL H. Stimulation of human peripheralblood lymphocytes by bioactive peptides derived from bovine milkproteins[J].FEBS Letters, 1996, 383(12): 18-20.

[5] LEBLANCE J G, MATAR C, VALDEZ J C, et al. Immunomodulating effects of peptidic fractions issuedfrom milk fermented with Lactobacillus helveticus[J]. Journal of Dairy Science, 2002, 85(11): 2733-2742.

[6] ALEJANDRA M L, MATAR C, CATHERINE T, et al. Effects of milk fermented by Lactobacillus helveticus R389 on immune cells associated to mammary glands in normal and a breast cancer model[J].Immunobiology, 2005, 9: 349-358.

[7] 張蓉真, 李瓏. 大豆水解蛋白對乳酸菌增殖的促進作用[J]. 糧油學(xué)報, 1997,12(6): 40-43.

[8] 趙新淮, 關(guān)瑞. 大豆蛋白水解物對乳酸發(fā)酵的促進作用[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1998, 9(1): 102-104.

[9] 呂嘉櫪, 成妮妮. 提高乳品中益生菌存活力的方法[J]. 中國乳品工業(yè), 2001, 29(6): 31-34.

[10] 朱艷靜, 李宇. 測定菌體濃度的簡便方法[J]. 工業(yè)微生物, 2006, 36(4): 47-49.

[11] 吳玲, 何穎. 瑞士乳桿菌增菌培養(yǎng)基的篩選[J]. 常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報, 2007(4): 129-131.

[12] 徐海軍, 尹富貴, 曾軍英, 等. 正交設(shè)計和均勻設(shè)計優(yōu)化酪蛋白酶水解參數(shù)的比較[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(12): 87-90.

[13] 寧正祥. 食品成分分析手冊[M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 1998: 119-124.

Effect of Casein Hydrolysate on Promoting the Growth of Lactobacillus helvecticus

HU Zhi-he1，OU Cui-yan1，ZHU Li-min2，F(xiàn)ENG Yong-qiang2，ZHANG Jian-jun2
(1. Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce,Tianjin 300134, China；2. Tianjin Haihe Dairy Co. Ltd., Tianjin 300402, China)

Effect of casein hydrolysate on promoting the growth of Lactobacillus helvectucus was studied and the hydrolysis condition was optimized based on the growth promoting effect. The results showed that optimal hydrolysis conditions of casein by trypsin included temperature at 37 ℃, pH value 8.0, substrate concentration 5%, ratio of enzyme to substrate 1:600, and hydrolysis time 180 min. Casein hydrolysate prepared at this optimal condition was added into L. helvectucus culture solution,and the addition of 1 g/100mL casein hydrolysate exhibited the highest promoting effect on the growth of L. helveticus, while addition more than 4 g/100mL had the inhibiting effect.

rrypsin；casein hydrolyzate；Lactobacillus helvecticus；growth promoting

TS201.3

A

1002-6630(2010)23-0188-06

2010-09-13

胡志和(1962—)，男，教授，碩士，主要從事專用功能食品研究與開發(fā)。E-mail：hzhihe@tjcu.edu.cn