蛋清蛋白質降壓肽的化學及酶穩定性研究

于志鵬，趙文竹，于一丁，劉博群，劉靜波*

(吉林大學軍需科技學院營養與功能食品研究室，吉林 長春 130062)

蛋清蛋白質降壓肽的化學及酶穩定性研究

于志鵬，趙文竹，于一丁，劉博群，劉靜波*

(吉林大學軍需科技學院營養與功能食品研究室，吉林 長春 130062)

以血管緊張素轉化酶抑制活性為指標，通過Plackett-Burman設計研究影響蛋清蛋白質降壓肽化學穩定性的因素，同時考察蛋清蛋白質降壓肽在模擬胃腸道環境中的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶裂解的穩定性。結果表明：pH值、溫度、光照、空氣、貯藏肽溶液的質量濃度、巴氏滅菌處理、超聲波及鎂離子等因素對蛋清蛋白質降壓肽的化學穩定性影響不顯著(P＞0.05)；蛋清蛋白質降壓肽經胃蛋白酶和胰蛋白酶水解后活性由46.0%分別下降為13.0%和4.0%，對胃蛋白酶和胰蛋白酶均沒有良好的耐受性。

蛋清蛋白質；肽；穩定性；血管緊張素轉化酶

血管緊張素轉化酶通過影響腎素-血管緊張素系統和激肽釋放酶-激肽系統對人體血壓調節有重要的生理作用[1]。研究發現，血管緊張素轉化酶抑制肽(降壓肽) 是一類具有抑制ACE 活性的物質。隨著人們對食品安全問題的高度關注，食源性降壓肽成為當前的研究熱點。自1965年首次在南美茅頭蝮蛇毒液中發現降壓肽[2]以來，國內外研究人員已從不同來源的蛋白質中制備出各種具有降壓活性的肽類物質[3-8]。但是這些研究主要集中在降壓肽的高效分離制備及構效關系的研究上[9-12]，而對貯存的環境條件、加工條件和胃腸道酶耐受性等性質對其活性影響卻報道很少。由于多肽中的氨基酸組成復雜，且各氨基酸性質不一，這使得其在生產、應用和貯存過程中存在著因脫酰胺、氧化、水解或環化等作用而發生降解的可能，甚至有可能導致活性完全喪失[13]。蛋清降壓肽無論是作為功能性食品還是藥品，最終都要攝入人體內才能發揮其降低血壓的作用。在人體胃腸道復雜的環境下，蛋清降壓肽容易受胃蛋白酶及胰蛋白酶的影響，其中高活性肽段的一級結構裂解失活，在體內失去降壓活性。因此蛋清降壓肽的抗胃腸道酶降解的能力成為一個很值得關注的問題。研究蛋清降壓肽活性穩定性對于制定科學的生產工藝和應用方法具有重要的指導意義，為進一步設計具有降壓活性的抗酶解活性肽提供理論依據。

本實驗在前期蛋清降壓肽研究的基礎上，對蛋清降壓肽的化學穩定性及在體外模擬胃腸道環境中抗胃腸道酶降解的能力進行研究，為蛋清降壓肽的工業化生產以及體內功能實驗和在小腸內的吸收轉運情況提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛋清蛋白粉 吉林金翼蛋品有限公司；血管緊張素轉化酶(ACE)、卡托普利(captopriL)、馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)、馬尿酸(hippμric acid)、胃蛋白酶和胰蛋白酶 美國Sigma公司；Alcalase 2.4L堿性蛋白酶 丹麥諾維信公司；乙腈(色譜純) 和三氟乙酸(色譜純) 天津市博迪化工有限公司，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LC-2010高效液相分析儀(紫外檢測器、C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)和LC solution 工作站) 日本島津公司；超速冷凍離心機 美國Sigma公司；100～1000μL 移液器和10～100μL移液器 Pipette 公司；CS-501型超級恒溫水浴鍋 上海錦屏儀器有限公司；ZD-2型自動電位滴定儀 上海精密科學儀器有限公司-雷磁儀器廠；AG204型電子天平 瑞士Mettle Toledo公司；HJ-6型多頭磁力加熱攪拌器 江蘇金壇榮華儀器有限公司；B-191噴霧干燥機 瑞士Buchi公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋清降壓肽的制備

取一定量蛋清蛋白質配制成一定質量濃度的水溶液，置于恒溫水浴鍋中90℃熱變性10min。冷卻至酶解溫度，用0.5mol/L氫氧化鈉溶液調解pH值至酶解條件，加入一定量的堿性蛋白酶進行水解，水解過程中不斷攪拌，并不斷加入適當質量濃度的氫氧化鈉溶液以維持pH值在規定的范圍內(±0.05)，水解3h后經80℃滅酶10min，9000×g離心10min，噴霧干燥，保存備用。

1.3.2 蛋白質水解度(DH)的測定

采用pH-stat法，參考文獻[14]方法進行。

1.3.3 血管緊張素轉化酶抑制活性測定

在Cushman等[15]方法基礎上進行了一些修改。取30μL HHL底物液，加入10μL抑制劑混合均勻，在(37±0.5)℃ 恒溫水浴中預熱3～5min，然后加人20μL ACE液充分混合，37℃保溫30min后，再加入60μL的1mol/L HCl終止反應，得到反應液。同時用10μL pH8.3的硼酸緩沖液替代抑制劑溶液作為空白對照組。該反應液用0.45μm濾膜過濾后直接用HPLC系統進行分析。色譜條件：柱溫25℃，流速0.5mL/min，流動相乙腈-水(0.05% TFA)體積比為25:75等度洗脫，檢測波長228nm。ACE抑制活性計算公式如下：

式中：M為空白對照組中馬尿酸的峰面積；N為添加抑制劑組中馬尿酸的峰面積。

1.3.4 蛋清降壓肽化學穩定性研究

影響活性肽穩定性的因素諸多，溫度、光照、超聲波、濕度、緩沖鹽的種類、pH值以及氧氣等對活性肽的穩定性都具有不同程度的影響。實驗中選定pH值(以磷酸緩沖鹽配置)、溫度、光照、空氣、貯藏肽溶液的質量濃度、巴氏滅菌處理、超聲波及鎂離子(硫酸鎂鹽)作為試驗因素進行考察。應用Minitab 15.1.0軟件對影響蛋清高F值寡肽穩定性的因素進Plackett-Burman設計(因素水平設計見表1)。對可能影響蛋清降壓肽化學穩定性的8個主要因素進行篩選，每個變量分別確定(+)和(－)兩個水平，以血管緊張素轉化酶活性抑制率為指標，共進行12次試驗以確定每個因素對蛋清降壓肽化學穩定性的影響。

表 1 蛋清降壓肽化學穩定性Plackett-Burman設計因素水平表Table 1 Factors and levels for stability of antihypertensive peptides from egg white protein

1.3.5 蛋清降壓肽抗酶解研究

在模擬胃腸道環境下，蛋清降壓肽還存在活性制約其體內作用的發揮。胃蛋白酶和胰蛋白酶是胃腸道環境中的兩種重要肽類水解酶，體外具有活性的肽段容易被胃蛋白酶和胰蛋白酶裂解，使其影響活性的關鍵氨基酸丟失，造成體外有活性而體內無活性的結果。抗胃蛋白酶和胰蛋白酶裂解能力對蛋清降壓肽在體內穩定存在至關重要。因此，實驗著重研究了蛋清降壓肽的抗胃腸道蛋白酶裂解的能力。實驗中按照《中華人民共和國藥典》第五部的要求制備人工模擬胃腸液(人工胃液的配制：人工胃液取稀鹽酸16.4mL，加水約800mL與胃蛋白酶10g，搖勻后，加水衡釋至1000mL；人工腸液的配制：取磷酸二氫鉀6.8g，加水500mL使溶解，用0.1moL/L氫氧化鈉溶液調節pH值至6.8，取胰蛋白酶10g，加水適量使溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1000mL即得)。取上述配制的人工胃液，人工腸液各10mL配制成10mg/mL的肽溶液，于37℃條件下胃液反應5h，腸液反應4h。反應結束后在100℃加熱15min，5000×g，－4 ℃條件下離心5min。按1.3.3節方法進行活性測定。

2 結果與分析

2.1 蛋清降壓肽化學穩定性

蛋清降壓肽生產和儲藏過程中，影響其血管緊張素轉化酶抑制活性的因素較多。通過PB設計對可能影響蛋清降壓肽活性穩定性的因素進行篩選，結果見表2。利用Minitab 15.1.0軟件進行數據處理。

表2 蛋清降壓肽化學穩定性Plackett-Burman設計試驗結果Table 2 Results of antihypertensive peptide stability determined by Plackett-Burman design

圖 1 蛋清蛋白質降壓肽的標準化效應Pareto圖Fig.1 Standardization effect of antihypertensive peptides from egg white protein

圖2 蛋清蛋白質降壓肽的標準化效應正態圖Fig.2 Normal distribution of standardization effect of antihypertensive peptides from egg white protein

按表2選定的各因素進行試驗，取樣測定酶活并取3次測量值的平均值分別計算各因素效應及標準化效應分布，結果見圖1、2。根據效應和系數估計值中溫度、空氣、巴氏殺菌和Mg2+的效應和系數均為正值，表明溫度、空氣、巴氏殺菌和Mg2+為影響蛋清蛋白質降壓肽降壓活性的正相關因素。但通過標準化效應圖來看，所考察的8個因素對蛋清蛋白質降壓肽的化學穩定性影響均不顯著。

2.2 蛋清降壓肽酶穩定性

通過模擬胃腸道環境實驗，蛋清蛋白質降壓肽經胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后，血管緊張素轉化酶抑制活性明顯下降(表3)。胰蛋白酶水解位點為賴氨酸和精氨酸的羧基端，胃蛋白酶的水解位點為苯丙氨酸、蘇氨酸和色氨酸的氨基端，這可能因為具有血管緊張素轉化酶抑制活性的肽段經胃蛋白酶或胰蛋白酶水解而失去或部分失去活性。但由于蛋清蛋白質降壓肽成分復雜，不能確定經胃蛋白酶和胰蛋白酶處理前后的活性肽結構的變化。

表3 降壓肽模擬體內環境處理結果Table 3 Results of antihypertensive peptide stability in mimic gastrointestinal environment

3 結 論

蛋清蛋白質降壓肽具有耐熱性，在酸性和堿性條件下活性均很穩定，蛋清蛋白質降壓肽的血管緊張素轉化酶抑制活性受超聲、光照和鎂離子等因素影響不顯著，但其他金屬離子對其活性穩定性的影響程度還需進一步深入研究。蛋清蛋白質降壓肽對胃蛋白酶和胰蛋白酶的耐受性不強，分別經兩種酶處理后降壓肽活性明顯下降。Miguel等[16]研究表明蛋清胃蛋白酶酶解產物對原發性高血壓大鼠(SHR)具有降壓作用。Fujita等[17]研究也表明來源蛋清的一種8肽經乳化喂養SHR后，降壓效果明顯提高，這可能是經乳化的活性肽提高了胃腸道酶的耐受性。

[1] 何瑞榮. 心血管生理學[M]. 北京: 人民衛生出版社,1987: 165-173.

[2] FERREIRA S H. A bradykinin-potentiating factor (bpf) present in the venom of bothrops jararaca[J]. British Journal of Pharmacology, 1965,24(1): 163-169.

[3] AHN J E, PARK S Y, ATWAL A, et al. Angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptides from whey fermented by Lactobacillus species[J]. Journal of Food Biochemistry, 2009, 33(4): 587-602.

[4] CONTRERAS M D, CARRON R, MONTERO M J, et al. Novel casein-derived peptides with antihypertensive activity[J]. International Dairy Journal, 2009, 19(10): 566-573.

[5] FAN Junfeng, HU Xiaozhong, SZESZE T, et al. Isolation and characterization of a novel angiotensin I-converting enzyme-inhibitory peptide derived from douchi, a traditional Chinese fermented soybean food[J].Journal of the Science of Food and Agriculture, 2009, 89(4): 603-608.

[6] LEE J K, HONG S, JEON J K, et al. Purification and characterization of angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides from the rotifer,Brachionus rotundiformis[J]. Bioresour Technol, 2009, 100(21): 5255-5259.

[7] LI Guanhong, WAN Juzhen, LI Guowei, et al. Novel angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides isolated from Alcalase hydrolysate of mung bean protein[J]. Journal of Peptide Science, 2006, 12(8):509-514.

[8] MEGIAS C, PEDROCHE J, YUST M D, et al. Purification of angiotensin converting enzyme inhibitory peptides from sunflower protein hydrolysates by reverse-phase chromatography following affinity purification[J]. Lwt Food Science and Technology, 2009, 42(1): 228-232.

[9] RHO S J, LEE J S, CHUNG Y, et al. Purification and identification of an angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide from fermented soybean extract[J]. Process Biochemistry, 2009, 44(4): 490-493.

[10] SHEIH I C, FANG T J, WU T K. Isolation and characterization of a novel angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptide from the algae protein waste[J]. Food Chemistry, 2009, 115(1): 279-284.

[11] TOVAR-PEREZ E G, GUERRERO-LEGARRETA I, FARRESGONZALEZ A, et al. Angiotensin I-converting enzyme-inhibitory peptide fractions from albumin 1 and globulin as obtained of amaranth grain[J]. Food Chemistry, 2009, 116(2): 437-444.

[12] WU J P, ALUKO R E, MUIR A D. Production of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides from defatted canola meal[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(21): 5283-5287.

[13] SEWALD N, JAKUBKE H D. Peptides: chemistry and biology[M].Weinheim: Federal Republic of Germany, 2002: 13-14.

[14] 于志鵬, 林松毅, 劉靜波, 等. 優化蛋清粉蛋白熱變性條件的研究[J].食品科學, 2007, 28(10): 229-232.

[15] CUSHMAN D W, CHEUNG H S. Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung[J]. Biochemical Pharmacology, 1971, 20(7): 1637-1648.

[16] MIGUEL M, RECIO I, GOMEZ-RUIZ J A, et al. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity of peptides derived from egg white proteins by enzymatic hydrolysis[J]. Journal of Food Protection, 2004, 67(9): 1914-1920.

[17] FUJITA H, SASAKI R, YOSHIKAWA R, et al. Potentiation of the antihypertensive activity of orally, a vasorelaxing peptide derived from ovalbumin, by emulsification in egg phosphatidyl-choline[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 1995, 59(12): 2344-2345.

Stability of Antihypertensive Peptides from Egg White Protein to Chemicals and Enzymes

YU Zhi-peng，ZHAO Wen-zhu，YU Yi-ding，LIU Bo-qun，LIU Jing-bo*
(Laboratory of Nutrition and Functional Food, College of Quartermaster Technology,Jilin University, Changchun 130062, China)

The stability of antihypertensive peptides from egg white protein to chemicals was evaluated by Plackett-Burman design and its stability in mimic gastrointestinal environment was also investigated by determining angiotensin converting enzyme activity. Results indicated that pH, temperature, light illumination, stock peptide concentration, Pasteurization treatment,ultrasonic treatment and magnesium ions had no significant effect on the stability of antihypertensive peptides. However, the stability of antihypertensive peptides was sensitive to pepsin and trypsin. The activity of antihypertensive peptides decreased to 13.0 % and 4.0 % from 46.0 %.

egg white protein；peptide；stability；angiotensin converting enzyme

TS253.1

A

1002-6630(2010)09-0023-04

2009-09-24

國家“863”計劃項目(2007AA10Z329)

于志鵬(1984—)，男，碩士研究生，研究方向為營養與功能食品。E-mail：yuzhipeng20086@sina.com

劉靜波(1962—)，女，教授，博士，研究方向為營養與功能食品。E-mail：ljb168@sohu.com