頂空固相微萃取氣質聯用測定蒜油揮發性成分

陶寧萍,楊 柳

(上海海洋大學食品學院,上海 201306)

頂空固相微萃取氣質聯用測定蒜油揮發性成分

陶寧萍,楊 柳

(上海海洋大學食品學院,上海 201306)

以蒜油揮發性成分的總峰面積及總峰面積與峰數的比值為評價指標,比較了不同萃取頭、吸附溫度、吸附時間及解吸時間對固相微萃取的萃取效率的影響,得到最佳萃取條件：85μm PA萃取頭、吸附溫度 40℃、吸附時間 35min、解吸時間 3min,結果表明：固相微萃取技術有效地吸附了蒜油中的揮發性成分,經N IST質譜數據庫檢索和文獻對照,共確定 27種成分,并且不需溶劑,分析簡單、快速、經濟。

頂空固相微萃取氣質聯用,揮發性成分,蒜油,超臨界 CO2萃取

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮大蒜 產地上海,購于上海新蘆苑集貿市場。

超臨界二氧化碳萃取儀 Spe-ed SFE,美國Applied Separations公司;固相微萃取裝置 手動進樣手柄、萃取頭 (100μmPDMS;85μmPA;85μm CAR/PDMS;75μm CAR/PDMS;65μm PDMS/DVB),美國 Supelco公司;氣質聯用儀 Trace MS,美國Agilent質譜公司;集熱式恒溫加熱磁力攪拌器DF-101S,鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備 采用超臨界流體萃取技術(Supercritical Fluid Extraction,SFE)制備蒜油,步驟如下：稱取經粉碎的新鮮蒜泥 30.00g,裝入超臨界萃取釜中。在溫度 40℃、壓力 15MPa、靜態循環 30min和動態萃取 90min的條件下進行萃取,收集得到淺黃色的蒜油提取物,有濃郁的蒜味。

1.2.2 萃取頭的老化 按照 Supelco公司推薦的條件,將 85μm PA萃取頭于 280℃下老化 1h;100μm PDMS萃取頭于 250℃下老化 0.5h;75μm和 85μm CAR/PDMS萃取頭于 300℃下老化 1h;65μm PDMS/ DVB萃取頭于 250℃下老化 0.5h,老化至無干擾峰出現。

1.2.3 頂空固相微萃取萃取條件的優化 取 3mL蒜油提取物,置于含有微型攪拌子的 15mL棕色頂空瓶中。平衡 30min后,調節電熱磁力攪拌器溫度至所需溫度,待溫度恒定后,設定轉速 800r/min,將樣品置于磁力攪拌臺上。將 SP ME針管插入頂空瓶的硅橡膠瓶墊,調整并固定萃取頭頂空體積中的位置,伸出纖維頭。待吸附完畢,縮回纖維頭,抽出針頭。將萃取頭抽出插入 GC-MS聯用儀,于 250℃解吸,進行GC-MS檢測分析。

固相微萃取過程中影響萃取效果的因素有很多,包括萃取頭的種類、吸附溫度、吸附時間和解析時間等。實驗以總峰面積及總峰面積與峰數的比值作為指標,來考察各因素對于頂空固相微萃取效果的影響,按表 1所列出的實驗條件進行單因素實驗。

表1 單因素實驗條件

1.2.4 GC-MS測定 色譜柱：DB-35彈性毛細管柱(30m×0.25mm ×0.25μm);程序升溫,起始溫度40℃,保持 3min,然后以 10℃/min的升溫速度升溫到 50℃,再以 4℃/min的升溫速度升溫到 120℃,最后以 12℃/min的升溫速度升溫到 240℃,保持 5min;載氣為 He,流量 0.8mL/min;汽化室溫度 250℃。

質譜條件：電子轟擊 (EI)離子源;電子能量70eV,燈絲發射電流為 200μA,離子源溫度為 200℃,接口溫度 250℃,檢測器電壓 350V。

1.2.5 定性定量方法

1.2.5.1 定性 實驗數據處理由 Xcalibur軟件系統完成。揮發性成分通過 N IST和W iley譜庫確認定性,僅報道匹配度大于 800(最大值為 1000)的鑒定結果。

1.2.5.2 定量 按峰面積歸一化法計算相對百分含量。

2 結果與討論

2.1 萃取頭的選擇

萃取頭是固相微萃取的關鍵部分。不同的纖維頭涂層種類和厚度對目標化合物的吸附萃取能力是不同的,而萃取頭的選擇取決于目標化合物的極性、沸點和分配系數等參數。實驗中采用 100μm PDMS、 65μm PDMS/DVB、85μm PA以及 75μm和 85μm CAR/PDMS五種不同涂層種類和厚度的纖維頭,在吸附溫度 30℃,吸附時間 30min以及解吸時間 5min下進行實驗,實驗結果如表 2、表 3所示。

不同萃取頭吸附蒜油的揮發性成分的總離子流圖如圖 1所示,各成分及其峰面積如表 2所示。

圖 1 不同萃取纖維頭吸附揮發性成分的GC-MS總離子流三維圖

從表 2看出,共 38種成分被檢測出,其中有 16種鏈狀含硫成分,10種環狀含硫成分及 12種非含硫成分。從表 3看出,五種萃取頭中吸附揮發性成分數目最多的是 85μm CAR/PDMS,其次是 75μm CAR/PDMS和 65μm PDMS-DVB。但從對蒜油揮發性成分的總吸附量來說,85μm PA顯示出良好的吸附能力,靈敏度最高,吸附量最大,其次為 65μm PDMS-DVB和 85μm CAR/PDMS。國內外研究均表明,大蒜所具有的諸多生物活性功能都歸因于其中的含硫成分。而85μm PA對蒜油中的含硫成分也表現出良好的吸附效果,吸附總量是五種萃取頭中最大的。

此外,本實驗選取了具有相同纖維涂層,但涂層厚度不同的 75、85μm CAR/PDMS。結果顯示：相較于75μm CAR/PDMS,85μm CAR/PDMS吸附的揮發性成分的數目更多且吸附量更大,顯示出對樣品更高的靈敏度。這一結果也與纖維涂層越厚,固相吸附量越大,靈敏度越高相一致。

綜合考慮對蒜油揮發性成分的總吸附量及其中重要的含硫成分的總吸附量,故選擇對兩者均有高靈敏度的 85μm PA進行后續實驗。

2.2 萃取條件的單因素實驗

圖2 溫度對萃取效率的影響

2.2.1 吸附溫度的影響 從圖 2看出,在 40℃之前,總峰面積隨吸附溫度的升高而增加。但在 40℃之后,總峰面積趨于平穩。在 30～35℃時,總峰面積與峰數的比值有一個輕微的下降過程,在 35～40℃,其數值又急劇地上升,在 40℃后,慢慢趨于穩定。經單因素方差分析,發現吸附溫度 30℃的總峰面積及總峰面積與峰數比值與 35℃的無顯著差異 (P＞0.05),但與 40℃的存在極顯著差異 (P＜0.01)。而 40℃的總峰面積及總峰面積與峰數比值與 45～50℃區間的差異不顯著 (P＞0.05)?？紤]到蒜油中大部分成分不穩定,萃取溫度不宜太高。因此,確定 40℃為最佳提取溫度。

表2 不同纖維頭對峰面積的影響

表 3 不同纖維頭對揮發性成分的影響

2.2.2 吸附時間的影響 從圖3可看出,在吸附時間10～35min時,隨著吸附時間的延長,總峰面積及總峰面積與峰數比值呈上升趨勢,纖維頭的吸附量明顯增加。經過單因素方差分析,在 10～35min時,總峰面積變化極顯著 (P＜0.01),而總峰面積與峰數比值變化顯著(P＜0.05)。但在 35min后,總峰面積及總峰面積與峰數比值差異不顯著 (P＞0.05),兩者的數值均基本趨于穩定,說明萃取頭在 35min時已基本吸附飽和。在纖維頭吸附飽和的狀態下,再增加吸附時間,吸附量增加有限,意義不大,故選擇 35min為最佳吸附時間。

表 4 超臨界萃取蒜油的揮發性成分的分析結果

圖3 吸附時間對萃取效率的影響

2.2.3 解吸時間的選擇 從圖 4可看出,在解吸1～2min時,總峰面積及總峰面積與峰數比值隨著解吸時間的延長而增加,但在 2min后,兩者的數值均增加緩慢,基本趨于穩定。對其進行單因素方差分析,發現解吸時間 1min的總峰面積及總峰面積與峰數比值與 2min的存在顯著差(P＜0.05)。但 2min的總峰面積及總峰面積與峰數比值與 3、4、5min區間的差異不顯著(P＞0.05),且兩者的數值基本上在吸附 2min后基本保持不變。這說明萃取頭在 250℃下解析 2min便能完全解析所吸附物質。為保證萃取頭上的樣品完全解吸掉,不對下次樣品造成污染,且考慮到萃取頭壽命,故確定 3min為最佳解吸時間。

圖4 解吸時間對萃取效率的影響

2.3 超臨界 CO2萃取蒜油揮發性成分的分析鑒定

選取 85μm PA萃取頭,在吸附溫度 40℃、吸附時間 35min和解吸時間 3min的條件下進行超臨界CO2萃取蒜油揮發性成分的吸附測定,其總離子流圖如圖 5所示。經 N IST圖庫檢索以及參考文獻[6-8],共檢出 27種成分,各成分及其相對含量如表4所示。

圖5 超臨界萃取蒜油的揮發性成分的 GC-MS總離子流圖

從表 5中可以看出,超臨界 CO2萃取的蒜油的揮發性成分主要以一些含硫化合物為主,也含有少量的酯類和醛類化合物。在檢測出的 27種成分中,鏈狀含硫成分有 13種、環狀含硫成分 9種以及 5種非含硫成分,其中含硫成分總含量高達 98.91%,而這些含硫成分是大蒜的主要生物活性成分。Block[9]等人發現,二烯丙基二硫醚和三硫醚具有抗血小板凝集活性。Yogeshwer[10]等人研究發現,大蒜中的二烯丙基硫化物能有效抑制癌癥的發展。

蒜油中的鏈狀含硫成分如二甲基三硫醚(0.50%)、烯丙硫醇 (1.71%)、甲基-1-丙烯基二硫醚(1.15%)、二烯丙基硫醚 (0.51%)、二烯丙基二硫醚(6.57%)和二烯丙基三硫醚(11.42%)等都是大蒜特征性風味物質,具有濃郁大蒜香味。其中對蒜油風味有較大貢獻的二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚是具有強烈的大蒜香氣的物質,但沒有催淚作用。此外,環狀含硫成分中 2,4-二甲基噻吩、二噻烷等都具有大蒜和洋蔥樣的香氣;非含硫成分中 2-丙烯醛(0.5%)具有強烈刺激性,有催淚作用,對風味有一定貢獻[11-12]。

Athanasios[13]等認為,蒜素熱分解生成烯丙基次磺酸和硫代丙烯醛,后者會進一步發生二聚反應形成 3-乙烯基-1,2-二硫雜-4-環己烯和 3-乙烯基-1,2-二硫雜-5-環己烯,因此這兩種化合物的含量可作為活性物質蒜素含量的指標。從表 5中可以看出,使用超臨界 CO2萃取的蒜油中,這兩種成分的含量高達 58.81%。而周海濱[14]等人利用 GC-MS對超臨界萃取的蒜素進行了研究,檢測出兩種成分的含量為 55.48%,說明使用頂空固相微萃取聯合氣質聯用能有效地分析鑒定超臨界 CO2萃取蒜油的揮發性成分。

此外,使用固相微萃取氣質聯用法分析超臨界CO2萃取的蒜油,檢測出環丁烯砜 (1.71%)和癸醛(0.06%)等成分,這一點在其它文獻中未見報道。

3 結論

3.1 五種萃取頭中吸附揮發性成分數目最多的是85μm CAR/PDMS,其次是 75μmCAR/PDMS和65μm PDMS-DVB。但從對蒜油揮發性成分的總吸附量和含硫成分的總吸附量來說,85μm PA顯示出良好的吸附能力,靈敏度最高,吸附量最大。

3.2 實驗確立頂空固相微萃取蒜油揮發性成分的最佳條件是：吸附溫度40℃,吸附時間 35min,進樣口溫度250℃,解析3min。在此萃取條件下,HS-SP ME法可以很好地吸附蒜油樣品的揮發性風味成分,通過GC-MS的分析檢測,可以得到良好的總離子峰圖。

3.3 超臨界萃取蒜油中揮發性成分主要以揮發性含硫化合物為主,還含有少量的酯類和醇類化合物(見表 4)。在所測定的 27種成分中,其中鏈狀含硫化合物 13種,環狀含硫化合物 9種,非含硫化合物 5種,含量分別為 34.54%、64.37%和 1.09%。SP ME技術結合 GC-MS對超臨界 CO2萃取蒜油的揮發性成分有較好的分析效果,且其具有操作方便、不需溶劑、成本低等優點,具有廣泛的開拓前景。

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Analysis of volatiles from garlic oil by headspace-solid phase m icroextraction-gas chrom atography-m ass spectrom etry

TAO Ning-ping,YANG L iu
(College of Food Science&Technology,ShanghaiOcean University,Shanghai 201306,China)

A m e thod for the de te rm ina tion of vola tiles from ga rlic oil us ing headsp ace solid p hase m ic roextrac tion (HS-SPM E)and gas chrom a tog rap hy-m ass sp ec trom e try(GC/MS)was p resented.By tota l p eak a rea and ra tio of tota lp eak a rea to num be r of p eaks used as the m a in eva lua ting indexes,the ana lys is p a ram e te rs of d iffe rent SPM E fibe rs,extrac tion t im e,extrac tion temp e ra ture,desorp tion t im e we re op t im ized.The op t im um extrac tion cond itions we re ob ta ined as follows：85μm PA fibe r,exp osure for35m in a t40℃,and desorp tion for3m in a t250℃. The results showed tha t SPM E was effec tive to ana lys is of the vola tiles in ga rlic oil,twenty-seven comp ounds we re identified.The m e thod is s imp le,quick,solventless and inexp ens ive.

headsp ace-solid p hase m ic roextrac tion-gas chrom a tog rap hy-m ass sp ec trom e try;vola tile;ga rlic oil; sup e rc ritica lCO2extrac tion

TS207.3

A

1002-0306(2010)03-0172-05

固相微萃取技術 (Solid Phase microextraction, SP ME)是一種新穎的集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體的萃取濃縮技術,它具有無需有機溶劑、簡單方便、快速、選擇性好且靈敏度高等優點[1],因而已廣泛用于食品揮發性風味成分的分析檢測,如檢測生熟鴨肉[2]、淡水魚[3]、醬油[4]、芒果[5]等的風味成分。大蒜因具有諸多的藥理作用,如抗菌、抗癌、抗氧化、提高機體免疫力以及降低血糖、血脂和血壓等功能而日益受到人們的關注,各類大蒜產品也越來越受到消費者的青睞。而在眾多的大蒜制品中,又以蒜油為主要形式之一。本工作首次使用頂空固相微萃取聯合氣質聯用分析超臨界 CO2萃取蒜油的揮發性成分,通過對萃取頭種類、吸附溫度、吸附時間和解析時間進行單因素實驗,以確定各因素對萃取效果的影響程度,確立最佳萃取條件。并在該條件下對超臨界 CO2提取蒜油進行定性分析,為進一步改善蒜油提取工藝和分離純化提供理論基礎,對開發大蒜深加工制品具有現實意義。

2009-05-21

陶寧萍 (1968-),女,博士,副教授,研究方向：食品營養與安全。