楊梅葉、枝和樹皮提取物抗氧化活性研究

傅燕玲,張 英,吳曉琴

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院,浙江杭州 310029)

楊梅葉、枝和樹皮提取物抗氧化活性研究

傅燕玲,張 英,吳曉琴＊

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院,浙江杭州 310029)

采用DPPH法、ABTS法、Rancimat法及血液體系總抗氧化能力測定法研究楊梅葉、枝和樹皮提取物的抗氧化活性。結果表明,楊梅葉、枝和樹皮提取物清除DPPH·、ABTS+·能力顯著強于陽性對照。楊梅枝提取物清除DPPH·能力最強,為 1907.5±6.40mg TEAC/g,葉次之,皮最弱;楊梅葉提取物清除 ABTS+·能力最強,為 1692.90±31.81mg TEAC/g,枝次之,皮最弱。提取物對山茶油的抗氧化能力與其添加劑量呈量效關系,在 0.02%添加劑量下,各提取物對山茶油的抗氧化能力表現為 TBHQ＞皮提取物 ＞葉提取物 ＞枝提取物 ＞VE。血液體系總抗氧化能力從強到弱的排序依次為VC＞枝提取物 ＞葉提取物 ＞皮提取物。

抗氧化活性,DPPH·,ABTS+·,山茶油

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荸薺楊梅葉、枝和樹皮 2007年 7月份采于浙江余姚,40℃烘干,粉碎后過 20目篩;鮮榨山茶油; DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)、ABTS[2,2′-azino-bis-(3-ehyl benzothiazoline-6-sulfonic acid)、Trolox Sigma,美國;總抗氧化能力試劑盒 南京建成生物工程研究所;過硫酸鉀、特丁基對苯二酚(TBHQ)、維生素 E、維生素 C、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、福林-酚試劑、碳酸鈉、蘆丁、楊梅素、沒食子酸、無水乙醇、甲醇等 均為分析純試劑。

Ranc imat743食用油脂氧化穩定性測定儀 瑞士Metrohm公司;TU-1810紫外-可見 (UV-V IS)分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;FA1004型電子天平 (萬分之一) 上海精密科學儀器有限公司;R-201型真空旋轉蒸發儀 上海申科機械研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 楊梅葉、枝和樹皮有效成分的提取 采用70%乙醇熱回流浸提楊梅葉、枝和樹皮中有效成分。浸提溫度為 80℃,料液比為 1∶10,回流提取 2次,每次 2h,除去殘渣后旋轉蒸發回收溶劑。濃縮液溶于一定量水中,用石油醚除去蠟質、色素、油脂等弱極性物質,再以 1∶3溶劑量的乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯萃取物,旋轉蒸發除去溶劑,經冷凍干燥分別得到楊梅葉、枝和樹皮提取物(MLE、MBR、MBA)樣品,放入干燥器中備用。

1.2.2 DPPH·清除能力測定 在Bao等[5]所建立方法的基礎上進行改良,配制質量濃度為 0、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0mg/L的 Trolox溶液,分別取 50μL與5mL濃度為 1×10-4mol/L的 DPPH·甲醇溶液混合測定 517nm處的吸光值,建立標準曲線。配制一定濃度的樣品甲醇溶液,樣品的測定同標準曲線,以不加樣品的DPPH·甲醇溶液為空白,每個樣品平行測定三次。自由基清除率按下式進行計算：

式中：Acontrol為空白的吸光值;Asample為樣品吸光值。

1.2.3 ABTS+·清除能力測定 先將ABTS溶于甲醇中制備成 7mmol/L的儲備液,然后取 5mL ABTS儲備液和 88μL 140mmol/L的過硫酸鉀溶液混合,得到 2.45mmol/L的ABTS+·貯備液;將該溶液于 20℃下避光放置 12～16h。最后將生成的 ABTS+·儲備液用甲醇稀釋,使其在 734nm波長下的吸光值為0.70±0.02,即得到ABTS+·工作液。

參考 Re[6]等和 Cai[4]等的方法,配制濃度為 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mmol/L的 Trolox溶液,分別取40μL與 4mL ABTS+·溶液混合,搖勻,6min后于734nm下測定其吸光值,建立標準曲線。配制一定濃度的樣品甲醇溶液,樣品的測定同標準曲線,以不加樣品的溶液為空白,每個樣品平行測定三次。自由基清除率按下式進行計算：

式中：Acontrol為空白的吸光值;Asample為樣品吸光值。

1.2.4 對油脂抗氧化能力測定 采用 Ranc imat法,其基本原理是基于向一定溫度的油樣中通入一定流量的空氣,使油樣加速氧化,將氧化產生的揮發性小分子(如醛、酮、酸等)導入裝有蒸餾水的瓶中,記錄瓶中水的電導率變化情況,并求出誘導時間,記為I p。誘導時間越長,表明油樣抗氧化穩定性越好。

參考 Sun等[7]的方法,分別取 3g油樣至Ranc imat儀的樣品管,調節空氣流量為 20L/h,設定溫度為 120℃。準確稱取楊梅葉、枝和樹皮提取樣品,用少量甲醇溶解,并將其加入到山茶油樣品中,配制成樣品添加量分別為 0.02%、0.03%、0.04%、0.05%的油樣。以山茶油中添加相應量的溶解樣品的溶劑為空白,以相同劑量的 TBHQ、VE為陽性對照,分別測定空白、陽性對照和提取樣品對山茶油的誘導時間,并計算各陽性對照和試樣的相對抗氧化能力,每個樣品平行測定三次。

1.2.5 全血體系總抗氧化能力測定 原理：利用抗氧化物質能使 Fe3+還原成 Fe2+,后者可與斐林類物質形成穩定的絡合物的性質,從而可以通過比色法測定受試樣品在全血體系中抗氧化能力的強弱。

取一定量的血清,取一定濃度的樣品,按照總抗氧化能力試劑盒 (T-AOC)操作說明進行測試。以VC作為陽性對照。全血總抗氧化能力(T AC)計算方法如下：

其中,V0=3.8mL,V1=0.1mL;A1為加入提取物后反應體系的吸光度;A0為空白反應體系吸光度。

1.2.6 數據統計 采用 Excel和 SPSS 16.0軟件進行數據處理和統計分析。所有樣品均平行測定三次,測定結果以平均值 ±標準偏差(mean±SD)表示,顯著性界值 p=0.05。

2 結果與討論

2.1 清除DPPH·能力

DPPH法[8]自上世紀五十年代開始就用于天然產物的 H-供體的測定,后用于單一抗氧化物或天然物質的抗氧化能力測試。DPPH·是一種性質較為穩定的自由基,溶于甲醇、乙醇等極性溶劑中,在517nm處有最大吸收,當有自由基清除劑存在時, DPPH·的單電子由于被配對,會發生脫色反應,因此可用吸光度的變化并以 Trolox等作為對照體系量化抗氧化物質的抗氧化能力。本研究利用該法來比較楊梅葉、枝、樹皮提取物對DPPH·清除能力,以蘆丁作為陽性對照來評價其抗氧化能力,結果如圖 1、表1所示。

圖 1顯示,在低濃度范圍內,隨著試樣濃度的增大,自由基的清除率呈線性增長,當達到一定濃度時,自由基的清除率趨于平緩。提取物中清除 DPPH·的能力為枝最強,其半抑制濃度達 1907.5±6.40mg TEAC/g,其次是葉和皮,都明顯強于陽性對照蘆丁,這說明楊梅葉、枝和樹皮乙酸乙酯萃取物都有較強的清除DPPH·能力。DPPH·有一定選擇性,它不和B-環上無羥基的黃酮類物質發生反應,也不與芳香酸 (aromatic acid)反應[9],因此,相對于楊梅葉和樹皮提取物來說,楊梅枝提取物的 B-環上無羥基的黃酮類物質和芳香酸含量可能相對較少。

表 1 楊梅葉、枝、樹皮提取物清除DPPH·和ABTS+·的抗氧化能力

圖1 楊梅葉、枝、樹皮提取物和陽性對照蘆丁清除DPPH·的濃度依賴關系(n=3)

2.2 清除ABTS+·的能力

ABTS法是使用最廣泛的間接檢測方法,可用于親水性和親脂性物質抗氧化能力測定。ABTS經氧化后生成穩定的藍綠色陽離子自由基 ABTS+·,能溶于水相或酸性乙醇介質中,在 734nm處有最大吸收。當有自由基清除劑存在時能與ABTS+·發生反應而使反應體系褪色。在ABTS+·的最大吸收波長檢測吸光值的變化,并與 Trolox比較從而換算出被測物質總的抗氧化能力。楊梅葉、枝、樹皮提取物清除ABTS+·情況如圖 2、表 1所示。由圖 2可見,隨著試樣和陽性對照濃度的增加,其 ABTS+·清除率呈穩步增大,當試樣濃度達到一定濃度時,ABTS+·清除率呈緩慢增長趨勢。由表 1可看出,楊梅葉、枝和樹皮提取物清除ABTS+·能力顯著強于陽性對照蘆丁,其中以楊梅葉最強,為 1692.90±31.81mg TEAC/g,其次是枝,皮最弱。據文獻報道[10],天然植物提取物清除 ABTS+·能力與其總酚含量呈正相關,楊梅葉、枝與樹皮提取物清除ABTS+·能力存在顯著差異,這種差異可能就是由其總酚含量差異所致。

圖2 楊梅葉、枝、樹皮提取物和陽性對照蘆丁清除ABTS+·的濃度依賴關系(n=3)

2.3 楊梅葉、枝和樹皮提取物的抗油脂氧化能力

取一定量山茶油,分別加入油樣量的 0.02%、 0.03%、0.04%、0.05%的楊梅葉、枝和樹皮提取物,置于 Ranc imat743儀中,通過電導率的變化來確定誘導時間的長短。楊梅葉、枝和樹皮提取物及陽性對照TBHQ、VE對山茶油抗氧化作用測定結果如表 2所示,其中各種抗氧化劑的抗氧化能力用保護系數 Pf表示,Pf=I p樣品 /I p空白。

表 2 120℃時不同添加量的楊梅葉、枝、樹皮提取物對山茶油的保護系數 Pf

由表 2可知,楊梅葉、枝、樹皮提取物加入到山茶油都能明顯延長山茶油誘導時間,而且隨著添加量增加,其誘導時間增長,這表明提取物添加劑量與其抗氧化活性之間存在量效關系。當添加量在0.03%以上,其 Pf都大于 2,表明楊梅葉、枝、樹皮提取物對山茶油具有很好的抗氧化能力。當添加量為0.02%時,各物質對山茶油的抗氧化能力表現為TBHQ＞皮提取物 ＞葉提取物 ＞枝提取物 ＞VE。

2.4 總抗氧化能力測定

評價提取物總抗氧化能力的方法因其作用機理的差異可分為直接法和間接法。直接法是研究含有抗氧化物質的樣品對整個測試系統的氧化降解性,氧化的對象可能為單一脂類、脂混合物、蛋白質、DNA或者是含脂的混合物,如血漿、低密度脂蛋白和生物膜等[10]。直接法研究抗氧化物質在自由基的引發、傳遞、清除等過程中所起的作用,在理論上更為充分。因此為了更好更全面評價楊梅葉、枝和樹皮提取物抗氧化能力,采用血體系液總抗氧化能力來評價。該種方法實質是測試樣品在生物體系中的還原能力,實驗以VC作為陽性對照,結果如表 3所示。抗氧化能力從強到弱的排序依次為VC＞枝提取物 ＞葉提取物 ＞皮提取物。

表 3 楊梅葉、枝、樹皮提取物總抗氧化能力

3 結論

采用DPPH·和ABTS+·清除法研究楊梅葉、枝和樹皮提取物的抗氧化能力,是一種快速、簡便、靈敏可行的方法。楊梅葉、枝和樹皮提取物具有較好的清除DPPH·和ABTS+·的作用,明顯強于陽性對照蘆丁,且隨著化合物濃度的增加,對 DPPH·和ABTS+·的清除作用逐漸增強,表明提取物劑量與清除自由基的能力間存在量效關系。其中以楊梅枝提取物清除DPPH·能力最強,葉次之,皮最弱;楊梅葉提取物清除ABTS+·能力最強,枝次之,皮最弱。

楊梅葉、枝和樹皮提取物在山茶油中均有較強的抗氧化活性,在一定添加劑量范圍內,其抗氧化活性與添加量存在量效關系,且 0.05%提取物的效果優于0.02%TBHQ;在0.02%添加劑量下,各種提取物對山茶油的抗氧化能力表現為 T BHQ＞皮提取物 ＞葉提取物 ＞枝提取物 ＞VE。在全血體系下的抗氧化評價實驗能更加真實反映提取物的抗氧化能力,結果顯示其抗氧化能力從強到弱的排序依次為 VC＞枝提取物 ＞葉提取物 ＞皮提取物。

本研究結果表明,楊梅葉、枝和樹皮提取物含有較好的清除自由基,抗山茶油氧化及全血抗氧化能力,是一種極有潛力的天然抗氧化劑資源,其在食品、化妝品及藥品方面的研究將成為今后的工作重點。

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Study on antioxidant activity ofMyrica Rubra leaves, branches and barks extract

FU Yan-ling,ZHANG Y ing,W U Xiao-qin＊
(College ofBiosystem Engineering and Food Science,ZhejiangUniversity,Hangzhou 310029,China)

2,2-D ip henyl-1-p ic rylhyd razyl(DPPH),2,2′-Azino-b is-(3-ehylbenzothiazoline-6-sulfonic ac id (ABTS),Ranc im a t and tota l antioxidant ab ility in b lood assays we re used to ana lyze the antioxidant ab ility of M yrica Rub ra leaves,b ranches and ba rks extrac t.It showed tha t,M yrica Rub ra leaves,b ranches and ba rks extrac t showed s tronge r ab ility to scavenge free red ica ls when comp a ring to the control samp le.Am ong them,w ith the abundance of1907.5±6.40m g TEAC/g,the b ranches extrac t showed the s tronges t ab ility to scavenge DPPH·, then followed by leaves and ba rks,while w ith the abundance of1692.90±31.81m g TEAC/g,the leaves extrac t showed the s tronges t ab ility to scavenge ABTS+·,followed by b ranches and ba rks.It was a dosage-dep endent effec t be tween the antioxidant cap ab ility to cam e llia oil and the add ing am ount,w ith the add ing am ount of0.02%, the antioxidant ab ility to cam e llia oil of extrac ts was as follows：TBHQ ＞ba rks extrac t＞leaves extrac t＞b ranches extrac t＞VE,and the tota l antioxidant comp e tence in the b lood cond ition was as follows：VC＞b ranches extrac t＞leaves extrac t＞ba rks extrac t.

antioxidant ab ility;DPPH·;ABTS+·;cam e llia oil

TS255.1

A

1002-0306(2010)03-0196-04

楊梅 (M yrica rubaSieb.et Zucc)系楊梅科楊梅屬植物,它的果實、葉和樹皮含有豐富的多酚類物質。楊梅葉中含多種酚類化合物,主要由黃酮類化合物及花色素類化合物組成,這兩類化合物均有顯著的生理活性[1]。楊梅樹皮可分離出楊梅素、槲皮素及槲皮素-o-α-L-鼠李糖苷等黃酮類化合物[2],且味苦、性溫,具有散瘀止血、止痛之功效,民間用于治療跌打損傷、骨折、痢疾、胃和十二指腸潰瘍、牙痛等[3]。人體內的氧化和抗氧化處于動態平衡,當這種平衡被打破就會發生氧化應激。人體能通過自身的調節耐受輕度的氧化應激,但嚴重的氧化應激則需要補充抗氧化劑來補救。許多現代文明病與人體缺乏抗氧化營養物質有關,而補充抗氧化營養物質則有助于對這些疾病的預防治療,因此尋找天然、安全、有效的抗氧化劑資源就顯得尤為重要。本文采用熱回流法提取楊梅葉、枝和樹皮中的有效成分,通過清除自由基,對油脂的抗氧化及全血體系抗氧化等方法對提取物抗氧化作用進行研究,以期為綜合開發利用楊梅非果部位資源提供一定的參考。

2009-04-03 ＊通訊聯系人

傅燕玲(1984-),女,碩士研究生,研究方向：天然產物的研究與開發。