棕檬酸與胃蛋白酶協同水解牛骨粉的工藝優化

尹彥洋,羅愛平,＊,伍賢位,吳 敏

(1.貴州大學生命科學學院,貴州貴陽 550025; 2.銅仁職業技術學院,貴州銅仁 554300)

棕檬酸與胃蛋白酶協同水解牛骨粉的工藝優化

尹彥洋1,羅愛平1,＊,伍賢位1,吳 敏2

(1.貴州大學生命科學學院,貴州貴陽 550025; 2.銅仁職業技術學院,貴州銅仁 554300)

以新鮮牛骨為原料,探討牛骨粉的制備工藝;采用對比和正交實驗相結合的設計方案,用檸檬酸與胃蛋白酶協同水解牛骨粉,以水解度、鈣溶出率為特征性指標,三氯乙酸中可溶性氮含量評定水解效果。結果表明:牛骨在 121℃, 0.14MPa條件下,蒸煮 120min全部松軟,蛋白質暴露面積增加,有利于其水解;用檸檬酸水解牛骨粉,水解度與鈣溶出率呈極顯著相關性(P<0.01);檸檬酸與胃蛋白酶協同水解牛骨粉的最佳條件:檸檬酸濃度 0.5mol/L、酶與底物蛋白量比(E/S)為 500U/g、底物濃度 11%、反應時間為 6h,水解度與鈣溶出率分別達 33.7%和 11.2%;三氯乙酸中可溶性氮含量達到 97.2%,表明大部分產物為低分子肽類,溶解性高。

牛骨粉,檸檬酸,胃蛋白酶,水解度,鈣溶出率

牛骨約占胴體重的 20%～30%[1],是一種營養價值非常高的肉類加工副產品。骨骼中含有豐富的蛋白質,其中 90%為膠原、骨膠原及軟骨素[2],具有增強皮下細胞代謝,延緩衰老的作用。骨蛋白是較為全價的可溶性蛋白質,生物學效價高[3]。據報道,骨粉中必需氨基酸含量為 5.518mg/100mg,占氨基酸總量的 20.67%[4]。檸檬酸為無色半透明晶體或白色結晶粉末,無臭、味極酸,易溶于水和乙醇,水溶液顯酸性。其與骨粉溶液作用,通過與結合釋放出H+,H+再與液體中、Ca2+等結合,骨粉中鈣與液體中不斷交換達到平衡,溶液呈酸性,磷酸鈣大部分與 H+作用生成磷酸氫鈣,可溶性鈣含量增加[5];檸檬酸作用于蛋白質,主要破壞蛋白質中的鹽鍵和酯鍵等副價鍵,使蛋白質二、三級結構受到破壞而變性分解,對于膠原蛋白,就是使膠原中鄰近膠原蛋白的連接處分解[6]。檸檬酸在生物體內參與機體的新陳代謝,無毒副作用[7],并為胃蛋白酶提供酸性環境。胃蛋白酶是一種內切酶,其作用是切開蛋白質分子內部肽鍵,將蛋白質水解成分子量較小的多肽。利用檸檬酸與胃蛋白酶協同作用,探討檸檬酸與胃蛋白酶水解牛骨粉的最佳工藝條件,可充分提高骨蛋白、骨鈣的利用率,為開發骨蛋白、骨鈣深加工產品提供理論依據和參數。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胃蛋白酶 (Poreme gastric Mucosa) 酶活力144000U/g,購于 sigma公司;新鮮牛管骨﹑扁骨 購于貴陽花溪農貿市場;檸檬酸 重慶川江化學試劑廠,分析純。

YX-28OB型蒸汽滅菌鍋 上海三申醫療器械有限公司;F100高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;PHS-SC型酸度計 上海康儀儀器有限公司;KDN-04A型凱氏定氮儀 上海昕瑞儀器儀表有限公司;THZ-98A恒溫振蕩培養箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛骨粉的制備工藝流程 新鮮牛骨→切割→清洗→加熱熬煮去脂→高壓蒸煮→去骨髓、骨油→風干→粗粉碎→細粉碎→過篩

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 切割 用切割機將牛骨切成 4～5cm的骨塊。

1.2.2.2 清洗去雜 清水洗凈牛骨,剔除筋、腱等非骨成分。

1.2.2.3 脫脂 牛骨塊置于鍋中,以蒸餾水剛好浸沒為宜,微沸 1h,除去殘血,取出脫脂。

1.2.2.4 蒸煮 0.14MPa分別蒸煮 60、90、120、150min,觀察骨骼軟化程度,計算原料損失率。

1.2.2.5 風干 60～70℃恒溫干燥 4～6h。

1.2.2.6 粗粉碎 將干燥后的骨塊進一步粗粉碎為1cm左右的小塊,再進行細粉碎。

1.2.2.7 細粉碎 過 160目篩。分別測定蛋白質、鈣、及含水率。

1.2.3 檸檬酸水解牛骨粉設計方案 采用單因素對比實驗方案,分別設實驗組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。以0.5mol/L檸檬酸溶液對牛骨粉進行處理,使牛骨粉懸液濃度為 9%,121℃高溫加熱處理 30min,水解溫度 37℃,時間 5h,酶量與底物蛋白量比(E/S)300U/g水解牛骨粉。以水解度和鈣溶出率為評定指標,實驗設計如下:

實驗組Ⅰ:不采用高溫加熱處理;實驗組Ⅱ:以蒸餾水代替檸檬酸溶液處理牛骨粉,使其濃度為9%,高溫處理后,添加檸檬酸,使其濃度達 0.5mol/L;實驗組Ⅲ:分別以檸檬酸濃度為 0.125、0.25、0.5、1、1.5mol/L處理牛骨粉;實驗組 Ⅳ:分別在 70、80、90、100、121℃溫度下加熱處理 30min;實驗組 Ⅴ:121℃高溫加熱處理時間分別為 10、20、30、40、50min。

1.2.4 胃蛋白酶水解牛骨粉設計方案 分別固定酶解溫度 37℃、底物濃度 9%、酶量與底物蛋白量比(E/S)為 300U/g、水解 5h。以水解度為指標,采用單因素實驗確定牛骨蛋白的水解條件。

1.2.4.1 酶解溫度的確定 在酶解溫度為 20、25、32、37、42、47℃條件下水解,確定最適酶解溫度。

1.2.4.2 底物濃度的確定 在底物濃度為 3%、5%、7%、9%、11%、13%條件下水解,確定最適底物濃度。

1.2.4.3 E/S的確定 在 E/S為 100、200、300、400、500、600U/g條件下水解,確定最佳 E/S。

1.2.4.4 酶解時間的確定在酶解時間為 2、3、4、5、6、7h條件下水解,確定最佳酶解時間。

1.2.5 測定指標

1.2.5.1 水分 按 GB/T5009.3—2003測定,直接干燥法。

1.2.5.2 脂肪 按 GB/T5009.6-2003測定,索式提取法。

1.2.5.3 鈣溶出率的測定 鈣含量測定:按 GB/T 9695.13-1988測定,高錳酸鉀法。

鈣溶出率(%)=酸與酶解液中鈣含量/牛骨粉中鈣含量 ×100%[8]

1.2.5.4 蛋白質、水解液總氮量測定 按 GB/T 5009.5-2003測定,凱氏定氮法。

1.2.5.5 游離氨基態氮測定 按 GB/T 12143.2-1989測定,甲醛電位滴定法。

1.2.5.6 水解度[9]水解度DH(%)=酸與酶解液中游離氨基酸態氮/酸與酶解液中總氮量 ×100%

1.2.5.7 原料損失率 損失率 (%)=[牛骨蒸煮前的重量 (g)-牛骨高溫高壓蒸煮后的重量 (g)]/牛骨蒸煮前的重量(g)×100%

1.2.5.8 三氯乙酸中可溶性氮 (TCA-NSI)含量[10]將20mL 20%三氯乙酸(TCA)溶液加到20mL酸與酶解液中,混合振蕩,靜置 60min后于 4000r/min離心20min,取上清液測定總氮量。TCA-NSI(%)=上清液中總氮量/酸與酶解液中總氮量 ×100%

2 結果與分析

2.1 牛骨粉的制備

在 121℃,0.14MPa條件下,高溫高壓蒸煮牛骨,可使骨骼軟化,增加骨中蛋白質的暴露面積,有利于蛋白質的水解。

表 1 不同蒸煮時間對部分牛骨軟化及損失率情況

表 1可知,牛骨隨蒸煮時間的延長而逐漸軟化,蒸煮 90min即可使大部分骨骼軟化,蒸煮 120min后骨骼全部軟化。隨著高溫蒸煮時間的延長,損失率也增大,這主要是高溫蒸煮使牛骨中明膠及脂肪酸逐漸離游出來。綜合考慮牛骨軟化程度及損失率,以 121℃,0.14MPa蒸煮 120min處理牛骨為佳。

2.2 檸檬酸與胃蛋白酶水解牛骨粉工藝條件的確定

2.2.1 檸檬酸水解牛骨粉工藝條件的確定

2.2.1.1 不同檸檬酸濃度處理骨粉對水解度和鈣溶出率的影響 牛骨粉在酸性條件下加熱時,骨蛋白的肽鍵斷裂,使原來在分子內部的非極性基團暴露于分子的表面,有利于水解。表 2可知,當檸檬酸濃度為 0.5mol/L時,水解度和鈣溶出率達最大值,分別為 30.0%和 9.6%,比最小值 0.125mol/L時分別高出7.3和 3.2個百分點,提高 32.2%和 50.0%。當檸檬酸濃度大于 0.5mol/L時,隨檸檬酸濃度的增大,水解度和鈣溶出率有所下降,其機理有待進一步研究。結果表明:檸檬酸濃度以 0.5mol/L為宜。

表 2 檸檬酸濃度對水解度和鈣溶出率的影響

2.2.1.2 不同溫度處理牛骨粉對水解度和鈣溶出率的影響 表 3可知,牛骨粉在酸性條件下經不同的溫度處理,其水解度和鈣溶出率隨溫度的升高而增大,121℃時達最大值,分別為 30.1%和 9.7%,比最小值 70℃時分別高出 10.0和 3.9個百分點,提高49.8%和 67.2%。結果表明:以 121℃處理牛骨粉為宜。

表 3 溫度對水解度和鈣溶出率的影響

2.2.1.3 不同時間處理牛骨粉對水解度和鈣溶出率的影響 表 4可知,牛骨粉在酸性條件下經不同的時間水解,30min時,鈣溶出率和水解度最高,分別為 30.1%和 9.7%,比最低值 10min時高出 7.6和 3.4個百分點,提高 33.8%和 54.0%。隨后略有下降,這是由于加熱時間過長造成熱變性,使蛋白質分子內部和分子間發生聚合,造成蛋白營養損失。結果表明:水解時間 30min為宜。

表 4 水解時間對水解度和鈣溶出率的影響

2.2.1.4 不同處理對牛骨粉水解度和鈣溶出率的影響 表 2～表 4可知,實驗Ⅰ組與實驗Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組比較,牛骨粉經高溫處理后,水解度及鈣溶出率均明顯提高,表明高溫處理有助于檸檬酸水解牛骨粉;實驗Ⅱ組與實驗Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組比較,牛骨粉在酸性條件下高溫處理后,水解度及鈣溶出率明顯提高,表明酸性條件下高溫處理有助于檸檬酸水解牛骨粉。

2.2.2 鈣溶出率與水解度之間的相關性分析 由表2～表 4可知,鈣的溶出率與水解度存在一定的相關性。用 SPSS 12.0軟件對不同檸檬酸濃度、溫度、時間酶解牛骨粉的水解度 (DH)和鈣溶出率進行相關性分析,得出不同預處理條件下水解牛骨粉水解度(DH)和鈣溶出率存在極顯著(P<0.01)的相關性。

2.2.3 酶解條件的確定

2.2.3.1 不同溫度對牛骨粉水解度的影響 溫度是酶解條件的重要參數,直接影響蛋白酶催化反應的速度和酶本身的穩定性。圖 1可知,溫度為 20～37℃時,隨溫度的升高水解度增大。37℃時水解度達最大值 29.8%;隨后隨溫度的升高水解度反而減小,這是由于溫度過高,酶失活,不利于水解。因此,以37℃水解牛骨蛋白為宜。

圖 1 不同溫度對牛骨粉水解度的影響

2.2.3.2 不同底物濃度對牛骨粉水解度的影響 圖 2可知,底物濃度為 3%～9%時,隨底物濃度的增加水解度逐漸增大,是由于在酶濃度恒定條件下,當底物濃度較小時,酶未被底物充分接觸,這時反應速率取決于底物濃度,隨底物濃度增大,酶與底物結合生成中間復合物增多,反應速度加快。底物濃度為 9%時,水解度達最大值 30.1%。當反應的底物濃度超過 9%時,隨底物濃度的增加水解度逐漸減小,可能是由于水解液的粘度隨底物濃度增加,影響蛋白酶擴散,不利于酶與底物充分接觸,不利于水解。結果表明:以底物濃度 9%為宜。

圖 2 不同底物濃度對牛骨粉水解度的影響

2.2.3.3 不同酶用量與底物蛋白含量對牛骨粉水解度的影響 圖 3可知,當酶與底物蛋白量比在100～300U/g時,E/S與水解度成正比;但當 E/S達300U/g以上時,再增加酶量,溶液中的酶與底物反應達到飽和,水解度趨于平穩。故以 E/S值 300U/g為宜。

2.2.3.4 不同酶解時間對牛骨粉水解度的影響 圖 4可知,當酶解 2～5h時,水解度隨酶解時間的增加而增大,5h時達 30.1%,而后水解度趨于平穩,這可能是底物被逐漸消耗,產物的抑制作用使酶活力逐漸下降所致。因此,以酶解時間 5h為宜。

圖 3 不同 E/S對牛骨粉水解度的影響

圖 4 不同酶解時間對牛骨粉水解度的影響

2.2.4 檸檬酸與胃蛋白酶協同水解牛骨粉工藝的優化 根據單因素實驗結果,固定檸檬酸水解時間30min,胃蛋白酶酶解溫度 37℃,選擇檸檬酸濃度、酶解時間、酶與底物蛋白量比 (E/S)、底物濃度四個因素,采用 L9(34)正交實驗設計,以蛋白水解度為評定指標,確定最優條件,正交實驗設計及結果見表 5。

表 5 L9(34)正交實驗結果

采用直觀分析法對各因素極差 R值大小比較可知,四因素對水解度的影響程度依次為:B>A>C> D,酶與底物蛋白量比是影響水解度的主要因素,其它依次為檸檬酸濃度,底物濃度,酶解時間對水解度的影響最小。表 5可知,檸檬酸與胃蛋白酶協同水解牛骨粉最佳工藝條件為:A2B3C3D3,即檸檬酸濃度0.5mol/L,酶與底物蛋白量比 500U/g,底物濃度11%,水解時間 6h。驗證實驗證實此條件下牛骨蛋白的水解度達33.70%,大于實驗組最大值,證明其為檸檬酸酸與胃蛋白酶協同水解牛骨蛋白的最佳組合。

2.2.5 水解產物特性分析 三氯乙酸中可溶性氮(TCA-NSI)含量是評價水解產物中小分子肽類的重要指標[11]。三氯乙酸中可溶性氮 (TCA-NSI)含量越大,表明產物為小分子肽類越多。依據優化的實驗組對牛骨進行水解,即檸檬酸濃度 0.5mol/L,E/S 500U/g,底物濃度 11%,酶解時間 6h。測得三氯乙酸中可溶性氮(TCA-NSI)含量和可溶性鈣的含量達97.2%和 11.2%,表明檸檬酸與胃蛋白酶協同水解牛骨蛋白產物絕大部分為小分子肽類,溶解性較高。

3 結論

3.1 牛骨在 121℃,0.14MPa高溫高壓下蒸煮 120min后骨骼全部松軟,骨中蛋白質的暴露面積增加,有利于蛋白質的分解。

3.2 檸檬酸水解牛骨粉,水解度與鈣溶出率呈極顯著(P<0.01)的相關性。

3.3 檸檬酸與胃蛋白酶協同水解牛骨粉的最佳條件:檸檬酸濃度 0.5mol/L、酶與底物蛋白量比 (E/S)為 500U/g、底物濃度 11%、反應時間為 6h,水解度和鈣溶出率分別達 33.7%和 11.2%。

3.4 檸檬酸與胃蛋白酶水解產物的 TCA-NSI達到97.2%,表明大部分產物為低分子肽類,具有高溶解性。

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Opti m ization of cooperative hydrolysis process of cattle bone powder by citric acid and pepsin

Y IN Yan-yang1,LUO A i-ping1,＊,W U Xian-wei1,W UM in2
(1.Guizhou University College ofLife Sciences,Guiyang 550025,China; 2.Tongren Vocational and Technical College,Tongren 554300,China)

Fresh bone as raw m a te ria l to exp lore the p rep a ra tion of ca ttle bone p owde r,use of control and orthogona l exp e ri m enta l des ign,use of c itric ac id and p ep s in in the coord ina tion of hyd rolyzed p rote in, cha rac te rized by the deg ree of hyd rolys isind ica tors,Trichloroace tic ac id of solub le nitrogen ac id hyd rolys is nitrogen content to be in effec t.The results showed tha t:bone a t121℃,0.14M Pa cond itions,a ll soft120m in cooking, exp osure to inc rease the s ize of p rote in,benefic ia l to the decomp os ition;c itric ac id hyd rolys is ca ttle bone p owde r, the deg ree of hyd rolys is and ca lc ium d issolution ra te was highly s ignificant(P<0.01)re la tionship.C itric ac id and p ep s in hyd rolys is ca ttle bone m ea l in the bes t cond itions we re:c itric ac id concentra tion of0.5m ol/L,enzym e and p rote in subs tra te ra tio(E/S)400U/g,subs tra te concentra tion of11%,reac tion ti m e4h,hyd rolys is and d issolution ra te of ca lc ium up to33.7%and11.2%.Trichloroace tic ac id solub le nitrogen content reached97.2%.M os t of the p roduc twas the low-m olecula r-we ight p ep tides w ith high solub ility.

ca ttle bone p owde r;c itric ac id;p ep s in;hyd rolys is;ca lc ium d issolution ra te

TS251.94

B

1002-0306(2010)03-0248-04

2009-04-08 ＊通訊聯系人

尹彥洋 (1983-),男,碩士研究生,主要從事畜產品加工研究與開發。

貴州省科技廳資助項目(黔科合NY字[2007]3021號)。