抗氧化大豆多肽制備的研究

周婷婷,李 燕,宋 斐

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

抗氧化大豆多肽制備的研究

周婷婷,李 燕,宋 斐

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

以還原能力、清除超氧陰離子自由基和過氧化氫能力為指標(biāo),篩選制備抗氧化大豆多肽的水解酶及水解條件,得到高效的抗氧化大豆多肽制品。結(jié)果表明：選擇 1000U/g菠蘿蛋白酶、2000U/g中性蛋白酶、2000U/g堿性蛋白酶,三酶復(fù)合在 pH6.0,酶解溫度 50℃,底物濃度 8.0%的酶解條件下,對(duì)大豆蛋白酶解 4h,多肽的抗氧化能力表現(xiàn)最強(qiáng),還原能力達(dá)到 0.898,超氧陰離子自由基的清除率達(dá)到 40.93%,過氧化氫的清除率達(dá)到 33.37%。經(jīng)超濾分離,分子量小于 10KDa而大于 5KDa的多肽表現(xiàn)出較強(qiáng)的還原能力,而小于 5KDa的多肽表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除超氧陰離子自由基和過氧化氫的能力。

抗氧化,大豆多肽,酶解,超濾

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

全溶解大豆蛋白粉 河南安陽漫天雪大豆蛋白有限公司,蛋白質(zhì)含量約為 92.84%;菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶 SIG MA公司;抗超氧陰離子自由基與產(chǎn)生超氧陰離子自由基測(cè)試盒、雙氧水測(cè)試盒 南京建成生物科技研究所。

冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠,G L-20G-II;真空冷凍干燥器 CHR IST ALPHA1-2;超低溫冰箱海爾公司;RO-NF-UF-4100型膜分離裝置、中空纖維式超濾組件 (外壓式 PP-100、PS-5,內(nèi)壓式PS-10) 上海摩速科學(xué)器材有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆蛋白水解物的制備[4]稱取大豆蛋白溶于緩沖液中,90℃處理 5min,冷卻至一定溫度后,定容到原體積并調(diào)節(jié)pH至酶的最適值。置于恒溫水浴調(diào)節(jié)到酶的最適溫度,加入蛋白酶啟動(dòng)水解反應(yīng)。水解結(jié)束后,100℃滅酶 10min。冷卻后,4℃,5000r/min離心 15min,取上清液冷凍干燥,冷凍保存待用。

1.2.2 酶活力的測(cè)定 福林酚法[5]。

1.2.3 水解度的測(cè)定 甲醛滴定法[6]。

1.2.4 抗氧化能力的測(cè)定

1.2.4.1 樣品的還原能力[7]將 10mg樣品溶于 1mL蒸餾水中,加入 2.5mL 0.2mol/L PBS(pH6.6)和2.5mL 1%的鐵氰化鉀溶液,混勻,從上述混勻的混合液中取 1mL,然后加入 0.2mL 0.1%的三氯化鐵溶液混勻,再加 1mL蒸餾水搖勻,以蒸餾水調(diào)零,在700nm處測(cè)定吸光度。吸光度越高,說明樣品的還原能力越強(qiáng)。

1.2.4.2 樣品的抗超氧陰離子自由基能力 方法參照測(cè)試盒說明書。

1.2.4.3 樣品清除過氧化氫的能力 方法參照測(cè)試盒說明書。

1.2.5 超濾分離 將大豆蛋白酶解物離心,取上清液,經(jīng) 100kDa超濾膜 (PP-100中空纖維組件)截流分離,保留濃縮液;將濾液再經(jīng) 10kDa超濾膜(PS-10中空纖維組件)截流分離,保留濃縮液;將濾液再經(jīng)5kDa超濾膜 (PS-5中空纖維組件)截流分離,保留濃縮液。超濾過程保持組件最大工作壓力不超過0.15MPa,依次制備分子量為 100kDa以上、10～100kDa、5～10kDa、5kDa以下的大豆多肽溶液。然后將各部分溶液進(jìn)行真空冷凍干燥,分別測(cè)定各部分的抗氧化活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶的篩選

目前,用于水解大豆蛋白的水解酶主要有胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、細(xì)菌蛋白酶和霉菌蛋白酶等,要制備盡可能多的活性肽類產(chǎn)物,一般不應(yīng)選用端肽酶[8-9]。不同蛋白酶的專一性不同,酶切位點(diǎn)不同,導(dǎo)致水解產(chǎn)物中多肽也有區(qū)別,獲取抗氧化大豆多肽的數(shù)量、活性就有較大不同,因此蛋白酶的選擇尤為重要。

胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶,分別在各種酶的最適 pH和溫度下,以相同的酶量對(duì)大豆蛋白進(jìn)行酶解,以酶解物的還原能力、超氧陰離子自由基清除能力、雙氧水清除能力作為指標(biāo),篩選合適的蛋白酶。

2.1.1 還原能力的測(cè)定 此方法的原理為[10]：

樣品提供電子,使體系中 Fe3+還原成 Fe2+,在波長(zhǎng)為 700nm下測(cè)定最終反應(yīng)物的吸光度,吸光度越大,說明越多的 Fe3+被還原成 Fe2+,樣品的還原能力就越強(qiáng)。一般情況,樣品的還原能力與抗氧化能力呈正相關(guān)。

圖 1顯示,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),由各蛋白酶酶解得到的大豆多肽表現(xiàn)出的還原能力分別逐漸加強(qiáng),原因可能是隨著水解程度的加深,更多的活性基團(tuán)和位點(diǎn)暴露在外,提供電子的能力變強(qiáng),表現(xiàn)出更強(qiáng)的還原能力。中性蛋白酶和堿性蛋白酶的酶解物表現(xiàn)出比較高的還原能力,菠蘿蛋白酶的酶解物還原能力其次,胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解物還原能力較低。原因可能是前三種酶的水解能力較強(qiáng),在相同的時(shí)間內(nèi)使更多的基團(tuán)暴露在外;再有可能是前三種酶的酶切點(diǎn),更有利于具有還原能力的活性基團(tuán)或活性位點(diǎn)暴露出來。因此,從還原能力的角度,本研究選用中性蛋白酶、堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶。

圖1 酶解物的還原能力

2.1.2 清除超氧陰離子自由基能力的測(cè)定 超氧陰離子自由基是生命代謝中對(duì)生物體危害很嚴(yán)重的一種自由基,清除超氧陰離子自由基的能力是檢測(cè)樣品抗氧化性的重要指標(biāo)。

圖 2顯示,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),由各蛋白酶酶解得到的大豆多肽表現(xiàn)出清除超氧陰離子自由基的能力分別逐漸加強(qiáng),在酶解 10h時(shí)上升趨勢(shì)還很明顯,因此如果要得到清除超氧陰離子自由基的能力更強(qiáng)的大豆多肽,可以繼續(xù)酶解。中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶和堿性蛋白酶的酶解物表現(xiàn)出比較高的超氧陰離子自由基的清除能力,胃蛋白酶清除能力最低,因此,從清除超氧陰離子自由基能力的角度,本研究選用中性蛋白酶、堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶。

圖 2 酶解物的超氧陰離子自由基清除能力

2.1.3 清除過氧化氫能力的測(cè)定 過氧化氫與樣品反應(yīng),過氧鏈保留并轉(zhuǎn)移到樣品分子上,樣品生成新的過氧化物,被轉(zhuǎn)移的過氧鏈越多,即樣品接受過氧鏈的能力越強(qiáng),說明樣品的抗氧化能力越強(qiáng)。

圖 3顯示,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),由各蛋白酶酶解得到的大豆多肽表現(xiàn)出清除過氧化氫的能力分別逐漸加強(qiáng),胃蛋白酶在酶解 8h后酶解液清除能力上升趨勢(shì)變緩,但其他四種酶上升趨勢(shì)還很明顯,因此要得到清除過氧化氫能力更強(qiáng)的大豆多肽,其它四種酶可以繼續(xù)酶解。中性蛋白酶和堿性蛋白酶作用下的酶解物表現(xiàn)出比較高的過氧化氫清除能力,菠蘿蛋白酶酶解物清除能力其次,但在 7h后超過了中性蛋白酶酶解物清除能力,胃蛋白酶、木瓜蛋白酶的清除能力最差。因此,從清除過氧化氫能力的角度,本研究選用中性蛋白酶、堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶。

圖3 酶解物的過氧化氫清除能力

綜上所述,本研究選擇菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶。

2.2 酶解條件的篩選

2.2.1 pH、底物濃度和溫度的篩選 pH、底物濃度和溫度是大豆蛋白酶解過程的重要影響因素,最適酶解條件可以保證實(shí)際生產(chǎn)中酶解的高效性。本實(shí)驗(yàn)選用 L9(34)正交表,以水解度為指標(biāo),對(duì) 2000U/g的堿性蛋白酶、2000U/g的中性蛋白酶和 1000U/g的菠蘿蛋白酶三酶復(fù)合物的 pH、底物濃度和溫度進(jìn)行篩選,酶解時(shí)間為 6h,見表 1、表 2。

表 1 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

由表 2可知,三酶復(fù)合物酶解大豆蛋白的最適工藝條件是：酶解 pH 6.0,酶解溫度 50℃,底物濃度8.0%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,各因素對(duì)水解度影響的主次順序?yàn)椋旱孜餄舛?＞pH＞酶解溫度,且底物濃度對(duì)酶解程度的影響非常大,pH、酶解溫度對(duì)酶解程度的影響很小。

表 2 三酶復(fù)合酶解正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀分析表

2.2.2 酶解時(shí)間的篩選 在最適溫度、pH、底物濃度的酶解條件下,大豆蛋白得到最高效的酶解,以還原能力、清除超氧陰離子、雙氧水能力為指標(biāo),篩選酶解時(shí)間,以期達(dá)到短時(shí)、高效得到抗氧化能力較強(qiáng)的大豆多肽。

2.2.2.1 還原能力的測(cè)定 由圖 4可知,大豆蛋白酶解液的還原能力大于未酶解的大豆蛋白還原能力,且在 4h時(shí)酶解液的還原能力達(dá)到最大,前者為后者的 1.91倍。酶解 4h后酶解液還原能力逐漸變小,原因可能是在 4h后酶解液中具還原能力的基團(tuán)和位點(diǎn)更多地暴露出來,但隨著水解程度的加深,部分活性結(jié)構(gòu)被破壞,酶解出的活性基團(tuán)和位點(diǎn)其具有的還原能力不足以彌補(bǔ)被破壞的活性結(jié)構(gòu)所具有的還原能力。因此在上述酶解條件下,4h為制備抗氧化大豆多肽的最適時(shí)間。

圖4 樣品還原能力的測(cè)定結(jié)果

2.2.2.2 清除超氧陰離子自由基能力的測(cè)定 由圖 5可知,大豆蛋白酶解液清除超氧陰離子自由基的能力遠(yuǎn)大于未經(jīng)酶解的大豆蛋白的清除能力,且在 4h時(shí)酶解液清除超氧陰離子自由基的能力達(dá)到最大,為未酶解大豆蛋白的 3.12倍,之后逐漸變小。因此經(jīng) 4h酶解,可得到對(duì)超氧陰離子自由基有較強(qiáng)清除能力的大豆多肽。

圖 5 樣品清除超氧陰離子自由基能力的測(cè)定

2.2.2.3 清除過氧化氫能力的測(cè)定 由圖 6可知,大豆蛋白酶解液清除過氧化氫的能力遠(yuǎn)大于未經(jīng)酶解的大豆蛋白清除能力,且在酶解 4h時(shí)酶解液清除過氧化氫的能力達(dá)到最大,為未酶解大豆蛋白的 6.45倍,之后逐漸變小。因此經(jīng) 4h酶解,可得到對(duì)過氧化氫有較強(qiáng)清除能力的大豆多肽。

圖 6 樣品清除過氧化氫能力的測(cè)定結(jié)果

以還原能力、清除超氧陰離子自由基和過氧化氫能力為指標(biāo),在最適酶解條件下,大豆蛋白經(jīng) 4h酶解,制得的大豆多肽表現(xiàn)出的抗氧化性最強(qiáng)。

綜上所述,選擇 1000U/g菠蘿蛋白酶、2000U/g中性蛋白酶、2000U/g堿性蛋白酶,在 pH 6.0,酶解溫度 50℃,底物濃度 8.0%的酶解條件下,對(duì)大豆蛋白酶解 4h,抗氧化能力表現(xiàn)最強(qiáng),還原能力達(dá)到0.898,對(duì)超氧陰離子自由基的清除率達(dá)到 40.93%,對(duì)過氧化氫的清除率達(dá)到 33.37%。

2.3 超濾分離

對(duì)分子量為 100kDa以上、10～100kDa、5～10kDa、5kDa以下 4部分的大豆多肽取相同的量,進(jìn)行抗氧化能力測(cè)定。

由圖 7～圖 9可知,分子量分布在 10kDa以下的大豆多肽抗氧化能力表現(xiàn)較高,原因可能是小分子的多肽活性位點(diǎn)或基團(tuán)更多地暴露在外,能充分和自由基等結(jié)合,所以多肽分子量的大小與抗氧化性有著密切的聯(lián)系。具體為 10kDa以下 5kDa以上的多肽表現(xiàn)出更強(qiáng)的還原能力,而 5kDa以下大豆多肽表現(xiàn)出更強(qiáng)的清除超氧陰離子自由基和過氧化氫的能力。

圖7 不同分子量大豆多肽的還原能力

10kDa以下的大豆多肽得率為 37.52%,產(chǎn)率較高,滿足實(shí)際生產(chǎn)的要求。如需提高原料的利用率,可對(duì) 10kDa以上的大豆多肽進(jìn)一步進(jìn)行控制性水解。

3 結(jié)論

圖 8 不同分子量大豆多肽的清除超氧陰離子自由基的能力

圖 9 不同分子量大豆多肽清除過氧化氫的能力

3.1 選擇 1000U/g菠蘿蛋白酶、2000U/g中性蛋白酶、2000U/g堿性蛋白酶,三酶復(fù)合在 pH 6.0,酶解溫度 50℃,底物濃度 8.0%的酶解條件下,對(duì)大豆蛋白酶解 4h,還原能力、超氧陰離子自由基和過氧化氫的清除率達(dá)到最高,表現(xiàn)出較高的抗氧化能力。

3.2 大豆蛋白酶解液的抗氧化能力遠(yuǎn)大于未經(jīng)酶解的大豆蛋白的抗氧化能力,還原能力前者為后者的1.91倍,超氧陰離子清除率為 3.12倍,過氧化氫的清除率為 6.45倍。

3.3 10kDa以下 5kDa以上的多肽表現(xiàn)出更強(qiáng)的還原能力,而 5kDa以下的大豆多肽表現(xiàn)出更強(qiáng)的清除超氧陰離子自由基和過氧化氫的能力。

3.4 分子量分布在 10kDa以下的大豆多肽抗氧化能力表現(xiàn)較高,且得率較高,為 37.52%,滿足實(shí)際生產(chǎn)需要。

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Study on preparation of soybean peptides w ith antioxidant activity

ZHOU Ting-ting,L IYan,SONG Fei
(College of Food Science and Technology,ShanghaiOcean University,Shanghai 201306,China)

Suitab le enzym e and hyd rolys is cond itions we re se lec ted for p rep a ring soybean p ep tides w ith antioxidant ac tivity bas ing on reduc ing ab ility,ab ility of scaveng ing sup e roxide free rad ica l and hyd rogen p e roxide.Results showed that the p ep tides,which showed highes t antioxidant activity,were p rep ared by1000U/g b rom e la in,2000U/g neutra l p rotease and 2000U/g a lka line p rotease toge the r for4h unde r the hyd rolys iscond itionsof pH6.0, temp e ra ture a t50℃ and subs tra te concentra tion a t8.0%.Reduc ing ab ility reached0.898,ab ility of scaveng ing sup e roxide free rad ica l40.93%and ab ility of scaveng ing hyd rogen p e roxide33.37% sep a ra te ly.Afte r ultrafiltra tion p ep tides less than10kDa and m ore than5kDa showed s tronge r reduc ing ab ility and p ep tides less than5kDa showed s tronge r ab ility of scaveng ing sup e roxide free rad ica l and hyd rogen p e roxide.

antioxidant ac tivity;soybean p ep tides;hyd rolys is;ultrafiltra tion

TS214.2

B

1002-0306(2010)03-0281-04

機(jī)體防御體系的抗氧化能力的強(qiáng)弱與健康程度存在著密切聯(lián)系,該防御體系有酶促與非酶促兩個(gè)體系。酶促體系中起作用的酶主要是超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-PX)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶(GST)等;非酶促反應(yīng)體系中主要為維生素、多肽、氨基酸和金屬蛋白質(zhì),例如：VE、VC、蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸、組氨酸、乳鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等。目前市場(chǎng)上的抗氧化劑大多為人工合成,例如VE、VC,作用效果好,但化學(xué)合成物質(zhì)存在著安全隱患,它在清除自由基的同時(shí)也對(duì)人體的組織或器官產(chǎn)生副作用。研究表明,許多動(dòng)植物的水解蛋白、個(gè)別肽和氨基酸都有抗氧化性[1]。大豆多肽具有較高的抗氧化能力,有研究結(jié)果表明,大豆多肽對(duì)脂質(zhì)體系、非脂質(zhì)體系、酶系統(tǒng)、非酶系統(tǒng)、體外實(shí)驗(yàn)均有顯著的抗氧化作用[2]。因此相比較而言,沒有副作用的生物活性肽更具優(yōu)勢(shì)。另一方面,抗氧化大豆多肽的生產(chǎn)缺乏技術(shù)基礎(chǔ),抗氧化多肽提取耗時(shí)久、得率低、效果差、成本高,導(dǎo)致現(xiàn)在市場(chǎng)上的大豆多肽產(chǎn)品處于初級(jí)開發(fā)階段[3]。本實(shí)驗(yàn)旨在基于國(guó)內(nèi)外研究,即對(duì)抗氧化多肽分子結(jié)構(gòu)、分子大小與抗氧化生理功能的聯(lián)系,達(dá)到短時(shí)、高產(chǎn)率、低成本制得具有較強(qiáng)抗氧化能力的大豆多肽,為抗氧化大豆多肽產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)、生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

2009-05-06

周婷婷(1985-),女,碩士,研究方向：生物資源利用。