應用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設計優(yōu)化中國毛蝦蒸煮液酶解工藝的研究

張 井，李 燕，徐 靜，*，薛長湖

（1.溫州市農(nóng)業(yè)科學研究院食品科學研究所，浙江溫州325006；2.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003）

應用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設計優(yōu)化中國毛蝦蒸煮液酶解工藝的研究

張 井1，李 燕1，徐 靜1，*，薛長湖2

（1.溫州市農(nóng)業(yè)科學研究院食品科學研究所，浙江溫州325006；2.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003）

以蛋白水解度為指標，在中國毛蝦蒸煮液單因素酶解研究的基礎(chǔ)上，采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設計對其酶解工藝進行優(yōu)化。建立了蛋白水解度與酶解初始pH、酶解時間及蛋白酶用量三個實驗因素的正交回歸模型方程，根據(jù)回歸模型進行主效應分析，通過頻率分析法得到了酶解最佳工藝條件：酶解初始pH為7.6，酶解時間為8h，蛋白酶用量為0.51%（w/w），最佳條件下的水解度為38.8%。

中國毛蝦蒸煮液，二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設計，酶解

表1 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設計因子水平編碼表

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中國毛蝦蒸煮液 浙江省瑞安市華盛水產(chǎn)品加工廠提供，以冷凍方式運到實驗室，貯藏于-40℃冰箱備用；動物蛋白水解復合酶 酶活力60萬U/g，購于廣西南寧龐博生物工程有限公司；其它試劑 均為國產(chǎn)分析純。

電子分析天平 北京奧多利天平有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；METTLER TOLEDO DELTA320 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Anke GL-20G-II高速冷凍離心機。

1.2 酶解工藝

毛蝦蒸煮液解凍→低溫減壓濃縮→調(diào)節(jié)酶解初始pH→加動物蛋白水解復合酶→恒溫攪拌（50℃，300r/min）→滅酶（100℃，10min）→冷卻→離心（5000r/min，10min）→取上清液→測定清液中氨基酸態(tài)氮和總氮含量

1.3 分析測定方法

1.3.1 氨基酸態(tài)氮的測定 甲醛滴定法［6］。

1.3.2 總氮的測定 半微量凱氏定氮法［6］。

1.3.3 水解度（DH）測定 DH=離心液中氨基酸態(tài)氮含量/離心液中總氮含量

1.4 酶解單因素實驗

1.4.1 酶解初始pH對水解度的影響 酶解初始pH分別控制為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，酶解時間8h，蛋白酶用量（以酶/底物的質(zhì)量 ×100% 計，以下同）0.50%。

1.4.2 酶解時間對水解度的影響 酶解時間分別控制為4、6、8、10、12h，酶解初始 pH7.0，蛋白酶用量0.50%。

1.4.3 蛋白酶用量對水解度的影響 蛋白酶用量分別控制為0.25%、0.50%、0.75%、1.0%，酶解初始pH7.0，酶解時間8h。

1.5 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設計優(yōu)化酶解工藝

1.5.1 因素水平的確定 酶解的效果受到很多因素的影響，而且各個因素之間往往又存在交互作用，所以很難建立一個適應面廣泛的理論模型來反映酶解的全過程。針對傳統(tǒng)單因素實驗設計具有的明顯不足，在此采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設計對酶解工藝的主要影響因素進行實驗優(yōu)化。主要影響因素及其對應的零水平值，根據(jù)預先單因素實驗結(jié)果確定。

1.5.2 參數(shù)設計 變量參數(shù) p=3；星號臂值 r= 1.682；±1水平的因子點實驗全部實施為mc=2p=8；±r水平的星號臂點為mr=2p=6；為了使得二次旋轉(zhuǎn)組合設計具有正交性，各因素是零水平的中心點為m0=9；總實驗點n=mc+mr+m0=23。因子水平編碼見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解單因素實驗結(jié)果

2.1.1 酶解初始pH對水解度的影響 通常情況下，每種酶都有一個最適的pH，顯著的酶活性只發(fā)生在非常窄的pH范圍內(nèi)，因為蛋白酶和底物蛋白質(zhì)均有解離基團，只有這些解離基團處于特定的解離狀態(tài)時，酶分子與底物蛋白分子才會結(jié)合得快，生成產(chǎn)物的速度最快［7］。由圖1可知，隨著初始pH的增加，水解度迅速增加，當初始pH超過7.0時，水解度隨之下降。因此，酶解初始pH選擇在6.0～8.0之間較為合適。

圖1 初始pH對水解度的影響

2.1.2 酶解時間對水解度的影響 酶解時間的長短主要影響一定條件下酶解反應進行的程度。由圖2可知，反應開始時水解度增加趨勢較陡，當反應時間到達8h時，增加趨勢開始變緩。這可能是因為酶的催化速度會受到產(chǎn)物的影響，反應初期，產(chǎn)物的抑制作用小，隨著時間的延長，酶活力逐漸下降，游離的小肽和氨基酸增多，產(chǎn)物的抑制作用增加。因此，酶解時間選擇在6～10h之間較為合適。

圖2 酶解時間對水解度的影響

2.1.3 蛋白酶用量對水解度的影響 由圖3可見，不加蛋白酶時，由于底物中少量內(nèi)源性蛋白酶的作用，蛋白質(zhì)有所水解，但水解度不高。隨著外加蛋白酶濃度的增加，水解度也在緩慢增高，在實際操作中，不可能無限制地增加酶的濃度，且當?shù)鞍酌笣舛冗^大時，容易發(fā)生自水解，反而干擾了酶解物的組成。因此，蛋白酶用量選擇在0.4%～0.6%之間較為合適。

2.2 毛蝦蒸煮液酶解工藝的優(yōu)化

圖3 酶用量對水解度的影響

2.2.1 數(shù)學模型方程的建立 實驗結(jié)果見表2，采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)［5］對實驗數(shù)據(jù)進行擬合，得到回歸方程如下：

結(jié)合方差分析（見表3），在!=0.10顯著水平下剔除不顯著項，簡化后的回歸方程為

表2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設計及實驗結(jié)果

2.2.2 二次回歸模型的顯著性檢驗 為檢驗回歸方程的有效性，按F1=失擬均方/誤差均方，F(xiàn)2=回歸均方/剩余均方的程序進行檢驗。由表3可知，失擬項的F值為1.86705，P＞0.05，說明失擬檢驗不顯著，所采用的回歸模型適應于本反應性狀的分析。二次回歸模型的F值為7.88478，P＜0.01，說明模型的擬合極顯著，所建立的方程能夠較好地表達水解度與酶解初始pH、酶解時間及蛋白酶用量三個因素之間的關(guān)系。

由表3還可知，線性項X2未達到顯著水平，平方項未達到顯著水平，交互項X1X2、X1X3、X2X3未達到顯著水平，因此不需要做交互作用分析，以下僅對影響顯著的因素進行效應分析。

表3 實驗結(jié)果方差分析表

2.2.3 主要因素效應分析 由于本實驗設計滿足了正交設計的要求（一次項按正交表設計，二次項施行了中心化線性變換），因而模型中各項效應可以線性相加，偏回歸系數(shù)間彼此獨立，故可采用“降維法”分析，即固定任意兩個因子于某一水平，考察另一因子取不同值時產(chǎn)量的變化規(guī)律，這恰好相當于特定條件下所做的一組單因素實驗模型。本處理中將任意兩個因素固定在零水平，從而得到另一個因素與水解度之間的效應方程，經(jīng)處理后，得到的方程依次為：

由主效應方程可以做出各因素與水解度的關(guān)系圖（見圖4）。由圖4可知，在-1.682≤Xi≤1.682的范圍內(nèi)，酶解初始pH及蛋白酶用量與水解度之間接近線性關(guān)系，表明這兩個因素對水解度的影響較顯著，在一定范圍內(nèi)，隨著酶解初始pH及蛋白酶用量的增加，水解度也在提高。在整個水平范圍內(nèi)，酶解時間與水解度的之間接近呈水平線性關(guān)系，表明酶解時間對水解度無顯著影響。

圖4 實驗因子的主效應分析

2.2.4 最佳酶解方案 尋求模型的最優(yōu)解，就是模型方程在約束條件r：-1.682≤Xi≤1.682（i=1，2，3）內(nèi)的非線性規(guī)劃問題。用頻率分析法［5］解析，在-1.682≤Xi≤1.682區(qū)間，取步長為1，經(jīng)分析，其中水解度高于34.21%的方案有65個，見表4。

由表4可知，在95%分布區(qū)間內(nèi)，水解度高于34.21%的酶解方案為：酶解初始pH7.49～7.70，酶解時間7.64～8.36h，蛋白酶用量0.49%～0.53%。為實際操作方便起見，取最優(yōu)方案區(qū)間的平均值為最優(yōu)酶解條件，即：酶解初始pH為7.6，酶解時間為8h，蛋白酶用量為0.51%。經(jīng)驗證，此時蛋白水解度為38.8%。

表4 優(yōu)化方案中各變量取值頻率分析

3 結(jié)論

3.1 通過單因素實驗和二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設計實驗研究，得到了中國毛蝦蒸煮液酶解的最佳方案：酶解初始pH為7.6，酶解時間為8h，蛋白酶用量為0.51%（w/w）。在最佳酶解條件下，中國毛蝦蒸煮液中蛋白質(zhì)的水解度為38.8%。

3.2 建立了蛋白水解度（Y）與酶解初始pH（X1）、酶解時間（X2）及蛋白酶用量（X3）三個實驗因素的正交回歸模型方程：

Y=34.85711+1.83257X1-0.03595X2+0.83541X3-0.06250X1X3-0.28750X2X3，通過該方程可以對中國毛蝦蒸煮液中蛋白的水解程度進行較好地預測，對實際生產(chǎn)有一定的指導意義。

［1］章超樺，曹文紅，湛素華，等.中國毛蝦營養(yǎng)成分分析與評價［J］.福建水產(chǎn)，2001（1）：8-14.

［2］FAO/WHO.Energy and Protein Requirement.Rome：Food and Agricultural Organization of the United Nations，1973.

［3］付雪艷，薛長湖，寧巖，等.中國毛蝦酶解多肽降壓作用的初步探討［J］.海洋科學，2005，29（3）：20-24.

［4］章超樺，曹文紅，吉宏武，等.中國毛蝦ACE抑制肽的初步研究［J］.水產(chǎn)學報，2005，29（1）：97-102.

［5］唐啟義，馮光明.實用統(tǒng)計分析及其計算機處理平臺［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997：77-91.

［6］大連輕工業(yè)學院.食品分析［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，1990.

［7］趙梅，吳成業(yè).羅非魚下腳料酶解工藝的響應面法優(yōu)化［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28（1）：8-14.

Study on optimization of enzymatic hydrolysis of cooking juice of Acetes Chinensis through quadratic regression orthogonal rotational combinational design

ZHANG Jing1，LI Yan1，XU Jing1，*，XUE Chang-hu2
（1.Institute of Food Science，Wenzhou Academy of Agricultural Sciences，Wenzhou 325006，China 2.College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

Using the degree of hydrolysis as target，based on the single factor studied on the enzymatic hydrolysis conditions of cooking juice of Acetes Chinensis，the enzymatic hydrolysis conditions of cooking juice of Acetes Chinensis were optimized through quadratic regression orthogonal rotational combinational design.The quadratic regression model was of degree of hydrolysis to three factors of initial pH value，time and the concentration of enzyme.The best enzymatic hydrolysis conditions were analyzed and the results were as follows：initial pH value 7.6，time 8h，enzyme concentration 0.51%（w/w）.The degree of hydrolysis was 38.8%under above conditions.

cooking juice of Acetes Chinensis；quadratic regression orthogonal rotational combinational design；enzymatic hydrolysis

TS254.1

A

1002-0306（2010）07-0167-04

中國毛蝦（Acetes chinensis），又名蝦米，其蛋白質(zhì)含量高達72.9%（干基），必需氨基酸齊全，符合FAO/WHO推薦的理想蛋白質(zhì)模式，其獨特的氨基酸結(jié)構(gòu)使其在呈味、營養(yǎng)保健方面均具有較大的開發(fā)利用價值［1-4］。毛蝦蒸煮液是毛蝦加工成冷凍品或干制品過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，每加工1t毛蝦產(chǎn)品，就會產(chǎn)生1.5t左右蒸煮液。由于蒸煮液中含有大量蛋白質(zhì)、多糖等營養(yǎng)物質(zhì)，如果直接排入水體易引起水質(zhì)富營養(yǎng)化，對環(huán)境的污染極為嚴重。所以，以低值的中國毛蝦蒸煮液生產(chǎn)高附加值的蝦味海鮮調(diào)味料，特別是海洋功能性保健食品，既可充分利用廢棄資源，又可減少對環(huán)境的污染，不失為一種較好的開發(fā)利用途徑。二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設計是正交回歸實驗設計的一種，它既能分析各處理因子的影響，又能建立定量的數(shù)學模型，屬更高級的實驗設計技術(shù)［5］。動物蛋白水解復合酶主要由蛋白內(nèi)切酶、外切酶和風味酶組成，其作用原理是通過內(nèi)切酶切斷多肽內(nèi)部的肽鍵，通過外切酶每次從多肽鏈的末端釋放一個氨基酸，而風味酶則對水解的苦味和風味起著優(yōu)化作用。本文首先對動物蛋白水解復合酶酶解作用的初始pH、酶解時間及酶用量三個酶解條件進行單因素考察，在此基礎(chǔ)上，采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)設計法對酶解工藝進行系統(tǒng)優(yōu)化，通過頻率分析法得到最佳酶解條件，以期為中國毛蝦蒸煮液的深入開發(fā)利用提供一定的技術(shù)參考和理論依據(jù)。

2009-08-27 *通訊聯(lián)系人

張井（1984-），男，碩士，主要從事水產(chǎn)品加工及綜合利用研究。

國家863高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目（2007AA091801）；浙江省科技廳重大科技專項農(nóng)業(yè)項目資助（2007C12065）。