沙丁胺醇單克隆抗體的制備及間接ELISA方法的建立

彭述輝，袁利鵬，孫遠明，雷紅濤，*，王保玲，徐振林，龐 杰

（1.廣州城市職業(yè)學院，廣東廣州510405；2.廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室/華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州510640）

沙丁胺醇單克隆抗體的制備及間接ELISA方法的建立

彭述輝1，2，袁利鵬2，孫遠明2，雷紅濤2，*，王保玲2，徐振林2，龐 杰2

（1.廣州城市職業(yè)學院，廣東廣州510405；2.廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室/華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州510640）

制備抗沙丁胺醇單克隆抗體，鑒定其特異性并建立間接競爭ELISA檢測方法。以合成的沙丁胺醇完全抗原免疫Balb/c小鼠，利用雜交瘤技術(shù)進行細胞融合，篩選克隆得到穩(wěn)定分泌抗沙丁胺醇抗體的單克隆雜交瘤細胞，命名為4E4和3A2。經(jīng)鑒定，兩個抗體亞類都為IgG1，其腹水純化后效價分別達到2.56×105和1.28×105。以效價高且特異性較好的4E4細胞株獲得的抗體建立間接競爭ELISA方法，經(jīng)條件優(yōu)化后得到標準曲線，檢測范圍為4.76～84.99ng/mL，IC50為20.12ng/mL，檢測限為3.25ng/mL，與克倫特羅交叉反應率為253.62%，與其它結(jié)構(gòu)類似物沒有明顯交叉反應。本研究制備的單克隆抗體和建立的間接ELISA方法，可用于開發(fā)同時檢測沙丁胺醇和克倫特羅的試劑盒。

沙丁胺醇，單克隆抗體，間接ELISA

沙丁胺醇（salbutamol，SAL）是一種!-腎上腺素能興奮劑，主要用于防治哮喘和支氣管痙攣，但可減少胭體的脂肪含量，減少非胭體部分的脂肪沉積，促進飼料轉(zhuǎn)化率、增加瘦肉率［1-2］。由于近年來畜產(chǎn)品中克倫特羅、萊克多巴胺等“瘦肉精”含量超標引起的中毒事件不斷發(fā)生［3-4］，政府對“瘦肉精”的監(jiān)管力度不斷加強，不法商開始以SAL作為“瘦肉精”的替代品。過量攝入SAL會導致心悸、頭疼、目眩、惡心甚至損害肝腎［5］，其殘留嚴重危害著人們的身體健康和生命安全。作為一種潛在的“瘦肉精”替代品，很有必要加強對其的監(jiān)控。目前國內(nèi)外對SAL殘留的檢測主要采用儀器分析方法［6-9］。儀器檢測方法雖然準確、靈敏，但設備昂貴，樣品前處理復雜，需要專業(yè)人員才可操作，不適于大量樣品的篩選檢測。免疫分析方法操作簡便、快捷、高通量、靈敏度高，目前已經(jīng)成為食品安全快速篩選檢測的主要方法之一。Kunakar Pou［10］和Sean Chins［11］分別建立了SAL放射免疫分析，其檢測限可以達到0.01ng/mL和0.04ng/g，但由于放免分析的特殊性，使這一技術(shù)無法得到普遍的應用。史利軍［12］建立的SAL間接ELISA檢測方法，IC50為40.5ng/mL。本研究制備SAL單克隆抗體，建立了一種更加靈敏的間接競爭ELISA方法，為開發(fā)用于檢測SAL的試劑盒奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鼠骨髓瘤細胞SP2/0 本實驗室保藏；清潔級Balb/c純種雌性小鼠、普通級雌性昆明鼠 中山醫(yī)科大學實驗動物中心；沙丁胺醇完全抗原 本實驗室制備；HAT、HT、RPMI-1640培養(yǎng)基 美國Gibico公司；HEPES 上海博粵生物科技；PEG 4000 美國Sigma公司。

Wellwash MK2洗板機 美國 Thermo公司；ZHJH-1112超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司；TC-2323CO2培養(yǎng)箱 SHELDON公司；CHA倒置光學顯微鏡 日本OLYMPUS公司；Multiskan MK3酶標儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 單克隆抗體的制備［13］

1.2.1.1 動物免疫 取6～8周齡雌性Balb/c小鼠，分2組，3只/組，第1組小鼠編號為A、B、C，第2組設為陰性對照組 。腹腔注射免疫，每只小鼠100!g（以蛋白量計）沙丁胺醇免疫原SAL-BSA，每隔2周后同樣劑量腹腔和足墊注射加強免疫。三次免疫后尾部取血檢測小鼠血清效果。

1.2.1.2 抗血清效價的測定 利用間接ELISA測定，分別以不同濃度的SAL-OVA包被酶標板，小鼠抗血清倍比稀釋，抗血清效價為抗血清A450nm/陰性血清A450nm≥2.1時的抗血清的稀釋倍數(shù)。采用方陣滴定法優(yōu)化包被抗原濃度和抗血清工作濃度，選擇吸光值為1.0左右時的抗原濃度和抗體稀釋度作為工作濃度，采用間接競爭ELISA檢測血清的抑制效果。效價高抑制效果好的小鼠加強免疫，用于細胞融合。

1.2.1.3 細胞融合 將免疫小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞以個數(shù)5∶1的比例混合，用50%聚乙二醇（PEG）作為融合劑進行細胞融合，將融合好的細胞懸浮于HAT選擇性培養(yǎng)液，將混勻懸液分裝于有飼養(yǎng)細胞的24孔板中，于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育。

1.2.1.4 雜交瘤細胞篩選及亞克隆 融合后6～9d，用HT培養(yǎng)液半量換液1次，在12～14d后根據(jù)增殖情況改用完全培養(yǎng)液。待細胞貼壁至占板孔1/3時，取上清液，采用間接ELISA和間接競爭ELISA法進行陽性雜交瘤細胞篩選，顯示陽性并出現(xiàn)競爭抑制反應的孔為產(chǎn)SAL抗體的孔，顯微克隆和有限稀釋進行亞克隆。如此反復克隆2～5次，待所克隆的所有孔上清液中抗體陽性率為100%時，挑取單克隆細胞，擴大培養(yǎng)，建株。

1.2.1.5 腹水制備和抗體亞型鑒定 提前一周注射0.5mL液體石蠟至Balb/c小鼠腹腔。將細胞（每只小鼠1mL，含3.1×107個細胞）腹腔注射小鼠腹部，10～15d后，待小鼠腹部明顯膨大時采集腹水。ELISA法測定其效價，間接ELISA法鑒定單克隆抗體的免疫球蛋白類型和亞類。

1.2.1.6 純化抗體及蛋白質(zhì)含量測定 辛酸-硫酸銨沉淀法分離純化抗體。280nm紫外光譜測定，并按下列公式計算蛋白質(zhì)含量：

1.2.1.7 單克隆抗體的親和常數(shù)（Ka）測定 以1!g/mL SAL-OVA包被，間接ELISA法測定不同濃度的抗SAL單克隆抗體與包被抗原反應的A450nm值，以單克隆抗體濃度為橫坐標，以A450nm值為縱坐標，繪制反應曲線，并在曲線上找到趨于平坦段A值的50%所對應的單克隆抗體濃度，以其倒數(shù)作為親和常數(shù)Ka［14］。

1.2.2 單克隆抗體間競爭ELISA（icELISA）方法的建立 檢測ELISA酶標板均一性，用棋盤滴定確定最佳包被濃度和抗體稀釋倍數(shù)，采用常規(guī)ELISA操作步驟［15］，建立穩(wěn)定靈敏的ELISA間接競爭方法。四參數(shù)擬合曲線，計算 IC50，定量檢測范圍，確定檢測限。

1.2.3 沙丁胺醇icELISA特異性分析［16］以SAL濃度的常用對數(shù)值為橫坐標，以抑制百分率為縱坐標作圖，抑制曲線用Origin 7.5軟件進行擬合，抑制率為50%所對應的濃度即為IC50值。抑制率的計算公式為：

其中：Amax為不加藥物時的吸光值，Ax為藥物濃度為x時的吸光值，Amin為空白對照孔的吸光值。

以交叉反應率（cross reactivity，CR）評價方法的特異性。

CR=（沙丁胺醇的IC50/各結(jié)構(gòu)類似物的IC50）× 100%

2 結(jié)果與討論

2.1 抗血清效果分析

血清中抗體的效價越高，則說明有效抗體濃度越高，即小鼠的脾臟中激活的B淋巴細胞越多，有利于細胞融合。如圖1所示，3只小鼠抗血清800倍開始倍比稀釋，在相同包被濃度4!g/mL下，可以看出小鼠B免疫產(chǎn)生得血清效價最高。

采用濃度為10ng/mL SAL作為抑制藥物，對不同小鼠的血清進行間接競爭ELISA檢測。比較抑制情況如表1所示，3只小鼠中，小鼠B血清效價最高且藥物對其血清的抑制作用也最強，故選擇小鼠B進行細胞融合。

2.2 單克隆抗體亞類的鑒定和腹水效價測定

表1 SAL 抗血清的抑制效果

表2 酶標板均一性的檢測表

圖1 SAL抗血清效價測定曲線

經(jīng)過細胞融合，篩選克隆，得到2株穩(wěn)定分泌抗SAL抗體的雜交瘤細胞4E4和3A2。以4!g/mL的SAL-OVA包被酶標板，采用icELISA檢測方法檢測4E4、3A2兩株腹水抗體亞型。檢測結(jié)果抗體亞型都為IgG1。用間接ELISA測定4E4和3A2得到腹水的效價分別為1∶2.56×105、1∶1.28×105。

2.3 純化后抗體中的蛋白質(zhì)含量測定

辛酸-硫酸銨沉淀法純化腹水得到的抗體，按照公式（1）計算得到的蛋白濃度：4E4腹水純化后抗體濃度為8.12mg/mL；3A2腹水純化后抗體濃度為6.03mg/mL。

2.4 不同細胞株獲得抗體的特異性測定

以4!g/mL SAL-OVA包被酶標板，icELISA檢測抗體特異性。如圖2所示，雖然4E4和3A2兩株抗體的效價測定差距不大，但在抑制率曲線中4E4細胞株獲得的抗體的抑制情況明顯優(yōu)于3A2細胞株獲得的抗體，故選擇4E4細胞株分泌的抗體用于隨后實驗。

圖2 不同細胞株誘導抗體的抑制率曲線

2.5 SAL單克隆抗體的親和常數(shù)測定

以1.0!g/mL SAL-OVA包被，icELISA法測定單克隆抗體的親和力，結(jié)果如圖3所示，取趨于平坦段A450nm值為2.08的50%所對應的單克隆抗體濃度，以其倒數(shù)作為親和常數(shù)（Ka），所獲單克隆抗體的Ka為2.64×109L/mol。

圖3 SAL單克隆抗體的親和常數(shù)測定曲線（n=3）

2.6 ELISA酶標板均一性的測試

從不同的酶標板中隨機取酶標條4條，以1.0!g/mL包被原包被酶標條，其余按照icELISA步驟操作，A450nm下讀數(shù)，計算各孔間的變異系數(shù)，以檢驗酶標板的均一性。以表2測試數(shù)據(jù)為準，經(jīng)統(tǒng)計分析平均值為2.003，標準差為0.0686，樣本數(shù)為32，變異系數(shù)為4.1%，說明均一性良好，可以滿足實驗對SAL測定要求。

2.7 SAL-icELISA最佳檢測條件的確定

最佳包被濃度和抗體的稀釋倍數(shù)采用棋盤測定法確定，包被濃度會影響標準曲線的靈敏度，包被的濃度越小，與游離抗原的競爭力就會減弱，這樣會使曲線的靈敏度增加，但是包被濃度太小，就會影響Amax和曲線的穩(wěn)定性。由圖4可知，Amax在包被濃度為0.5～4!g/mL時呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，根據(jù)Amax值在1.0左右［17］比較靈敏的原則，在包被濃度為0.5!g/mL時，Amax為1.22，IC50值最小30ng/mL，且 Amax/IC50最高，說明其靈敏度最高，因此，在以后的實驗中選擇包被濃度0.5!g/mL，此包被時最適抗體稀釋倍數(shù)為256000倍。

圖4 包被濃度對Amax與IC50和Amax/IC50的影響

2.8 SAL-icELISA標準曲線

以0.5!g/mL SAL-OVA 4℃過夜包被酶標板，5%脫脂奶粉37℃孵育封閉3h，0.01mol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液液（PBS）稀釋的 SAL藥物和稀釋256000倍的單克隆抗體各50!L，37℃水浴反應1h后，加入1∶15000倍稀釋的HRP-羊抗小鼠抗體37℃水浴反應45min。以A450nm值為縱坐標，SAL濃度的負對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線，如圖5所示。得到的標準曲線檢測范圍為 4.76～84.99ng/mL，IC50= 20.12ng/mL，檢測限為3.25ng/mL。

圖5 沙丁胺醇icELISA標準曲線（n=3）

2.9 SAL-icELISA的特異性分析

采用沙丁胺醇icELISA方法，在幾種"-興奮劑的交叉反應曲線中，發(fā)現(xiàn)SAL單克隆抗體與克倫特羅有高的交叉反應，達253.62%（圖6）。而與其他結(jié)構(gòu)類似物交叉很小。萊克多巴胺的交叉率為1.25%，異丙腎上腺素為0.05%，去甲腎上腺素無交叉。

圖6 沙丁胺醇的交叉反應曲線

3 討論與結(jié)論

小分子偶聯(lián)蛋白BSA形成的完全抗原是一類比較特殊的抗原，它不像天然的蛋白抗原有多個抗原決定簇，它可能只有一個決定簇，所以其陽性率極低，在選擇免疫小鼠時候，要效價越高、抑制效果越明顯的越好，這樣脾臟中激活的B淋巴細胞才足夠多，融合的出現(xiàn)陽性的幾率才會大。抗體分泌株相比不分泌抗體的細胞株處于生長劣勢，其分泌特性如不及時建株極易喪失。本實驗室自制的顯微克隆系統(tǒng)，結(jié)合有限稀釋法成功地篩選到2株特異性細胞。所獲4E4單克隆抗體的親和常數(shù)（Ka）為2.64× 109L/mol，表明該抗體的親和力是較高的，高親和力抗體在免疫化學技術(shù)中使用效果較好，它在較短的時間內(nèi)比低親和力抗體能結(jié)合較大量的抗原，具有較高的活性，且復合物的穩(wěn)定性也較好。

邱陽生［18］所制備沙丁胺醇單抗對克倫特羅有50%的抑制率，史利軍［12］得到的單抗對克倫特羅交叉反應率達100%，本文的單抗建立的間接競爭方法對克倫特羅交叉反應率為253.62%，這種反應性能尚未在其他沙丁胺醇檢測研究中報道過。本文所用沙丁胺醇單克隆抗體與萊克多巴胺和異丙腎上腺素幾乎沒有交叉反應，盡管萊克多巴胺和異丙腎上腺素的異丙胺基與沙丁胺醇的叔丁氨基很相似，這表明抗體的識別能力非常精細。

綜上所述，本文所建立的單抗間接競爭ELISA模式適合同時檢測沙丁胺醇和克倫特羅，用于兩種藥物的同時篩查。

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Preparation of monoclonal antibody against salbutamol and establishment of indirect competitive ELISA

PENG Shu-hui1，2，YUAN Li-peng2，SUN Yuan-ming2，LEI Hong-tao2，*，WANG Bao-ling2，XU Zhen-lin2，PANG Jie2
（1.Guangzhou City Polytechnic，Guangzhou 510405，China；2.College of Food Science/Key Laboratory of Food Quality and Safety of Guangdong Province，South China Agricultural University，Guangzhou 510640，China）

Monoclonal antibody against Salbutamol（SAL）was prepared and the specificity of the antibody was identified to develop an indirect competitive enzyme-linked immunosobent assay（ELISA）for SAL.Splenocytes from mice immunized with SAL-BSA were fused with SP2/0 myeloma cells，and hybridomas secreting antibodies against SAL were selected and cloned.Two stable monoclonal antibodies 4E4 and 3A2 of subclasses IgG1were isolated and the titers of corresponding ascites were 2.56×105and 1.28×105，respectively.Based on the antibody produced by cell 4E4，an indirect competitive ELISA（icELISA）was developed for the quantitative detection of SAL. The IC50of standard curve was 20.12ng/mL and the limit of detection for SAL was 3.25ng/mL，with a linear ranged from 4.76 to 84.99ng/mL.The obtained SAL monoclonal antibody had 253.62% cross-reactivity（CR%）to Clenbuterol（CBL）and showed scarcely cross-reactivity with other structural analogs.The monoclonal antibody and the method was suitable for developing a commercial immunoassay kit for detecting the residue of SAL and CBL simultaneously.

salbutamol；monoclonal antibody；indirect competitive ELISA.

Q785

A

1002-0306（2010）07-0171-05

2010-01-28 *通訊聯(lián)系人

彭述輝（1965-），男，博士，副教授，主要從事食品科學教學和研究。

國家自然科學基金（20877029，30700663）；廣東科技計劃（Zgzhzd0808，2009B040500002，2009B080701068，2008B021400007）；國家863計劃（2007AA10Z437）；國家“十一五”科技支撐計劃（2006BAD27B02-05）；福建省自然科學基金（2009J01061）；福建省科技計劃社會發(fā)展重點項目（2008Y0006）。