中國大鯢可溶性蛋白制備及SDS-PAGE電泳分析

陳易彬,馬小燕

(陜西科技大學生命科學與工程學院,陜西西安 710021)

中國大鯢可溶性蛋白制備及SDS-PAGE電泳分析

陳易彬,馬小燕＊

(陜西科技大學生命科學與工程學院,陜西西安 710021)

采用超聲法制備大鯢可溶性蛋白質;從提取溫度、時間、液料比方面確定適宜的工藝參數,并對所得可溶性蛋白的分子量進行研究。均勻設計實驗結果表明:在提取溫度為 45℃、提取時間為 30min、液料比為 10∶1時,大鯢可溶性蛋白溶出量最多,達 63.57mg/g。SDS-PAGE電泳分析可溶性蛋白的組成表明,大鯢可溶性蛋白亞基分布廣泛,分子量低,易于消化吸收,為優質的營養蛋白。

大鯢可溶性蛋白,SDS-PAGE電泳

中國大鯢 (Andrias davidianus),俗稱“娃娃魚”[1],肉質鮮美,含有優質的蛋白質和豐富的氨基酸、微量元素,經常食用可以聰明益智、延緩衰老、提高造血和免疫功能,對防止心腦血管系統、惡性貧血和惡性腫瘤有很好的作用[2]。近年來,隨著人工馴養和繁殖技術的發展,大鯢產量大增,其食用和藥用價值也引起人們越來越多的重視。本工作采用超聲法制備大鯢可溶性蛋白,考察提取溫度、時間及液料比對制備效果的影響,確定其適宜的工藝參數,并對可溶性蛋白的分子量進行研究,為大鯢資源的進一步研究開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

大鯢 實驗室提供;牛血清標準蛋白 北京奧博星生物技術有限責任公司;考馬斯亮藍 G-250 天津市科密歐化學試劑開發中心;低分子量標準蛋白 香港昊柏技術有限公司;其它試劑 均為分析純。

K Q-200K DE型可調數控超聲儀 昆山市超聲儀器有限公司;UV-1800紫外可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司;DDY-10Cz型電泳儀、DYCZ-22A垂直板電泳槽 北京六一儀器廠;Bandscan 5.0軟件。

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲法制備大鯢魚肉中的可溶性蛋白

1.2.1.1 工藝流程 低溫取樣→加提取液研磨→超聲提取→離心→收集上清液→低溫儲藏[3]

1.2.1.2 單因素考察 分別以不同提取溫度、時間及液料比做單因素實驗,考察單因素對可溶性蛋白含量的影響。

1.2.1.3 均勻設計實驗 在單因素實驗基礎上,確定均勻設計實驗因素與水平[4]。以可溶性蛋白含量為指標,對大鯢可溶性蛋白的制備工藝條件進行優化。

1.2.2 大鯢可溶性蛋白的 SDS-PAGE電泳 采用15%分離膠、5%濃縮膠對可溶性蛋白進行 SDSPAGE電泳分析[5]。拍照并用 Bandscan5.0軟件分析。

1.2.3 可溶性蛋白含量測定 采用 Bradford法測定可溶性蛋白含量[6]。

1.2.4 蛋白質分子量的測定 在 Laemmli[7]方法中,蛋白質分子量的對數 (lg)與其相對遷移率呈良好的線性關系,因此,以標準蛋白質的分子量對遷移率作圖,得標準曲線。根據未知蛋白的遷移率,從標準曲線中查出其分子量。

2 結果與討論

2.1 標準曲線的繪制

配制最終濃度為 0、20、40、60、70、80、100μg/mL的標準蛋白質溶液,各取標準液 1mL,加入考馬斯亮藍 5mL,混合反應 2min后,在 595nm波長下比色測定吸光度,以蛋白質含量(μg)為橫坐標,以吸光度為縱坐標,得到的標準曲線方程為 y=0.005x+0.011, R2=0.998,線性范圍為 10～100μg/mL。

2.2 單因素對超聲法制備大鯢可溶性蛋白的影響

2.2.1 提取溫度的影響 在時間為 30min,液料比為10∶1的條件下,不同提取溫度對可溶性蛋白溶出量的影響如圖 1所示。

圖 1 提取溫度對提取效果的影響

由圖 1可以看出,當溫度低于 30℃時,蛋白質溶出量增加趨勢平坦;從 30℃開始蛋白質溶出量增加趨勢變得顯著;超過 45℃后,蛋白質溶出量開始下降。因此,45℃是提取可溶性蛋白質的適宜溫度。

2.2.2 提取時間的影響 在溫度為 45℃,液料比為10∶1條件下,不同作用時間對可溶性蛋白溶出量的影響如圖 2所示。

圖 2 提取時間對提取效果的影響

從圖 2可以看出,提取時間為 30min時,可溶性蛋白溶出量最多;提取時間低于 30min時,隨著提取時間的延長,可溶性蛋白溶出量增多,當到達 30min后,可溶性蛋白溶出量反而降低。因此,提取時間為30min為宜。

2.2.3 液料比的影響 在提取時間為 30min,提取溫度為 45℃條件下,不同液料比對可溶性蛋白溶出量的影響如圖 3所示。

從圖 3可以看出,可溶性蛋白溶出量隨液料比增加而迅速增加,在液料比 10∶1以上時,可溶性蛋白溶出量增加緩慢。因此,液料比選擇 10∶1較為合適。

2.3 均勻設計實驗優化結果

圖 3 液料比對提取效果的影響

根據單因素實驗結果,分別以提取溫度、提取時間、液料比為影響因素,以可溶性蛋白溶出量為指標,選擇3因素5水平的均勻設計實驗,實驗結果見表1。

表 1 均勻實驗設計和實驗結果

將表 1得到的實驗結果進行逐步回歸分析[8],得到回歸方程為:Y=45.7+0.441X1+0.264X2-0.931X3,復相關系數 r=0.9973。由以上方程可以看出:液料比對制備效果影響最大,且液料比越大,制備效果越差。其次為超聲溫度;超聲時間對制備效果影響最小。由此得出最佳超聲制備方案為:溫度 45℃,時間30min,液料比為 10∶1。

2.4 大鯢可溶性蛋白質的 SDS-PAGE電泳

采用 15%分離膠、5%濃縮膠對大鯢可溶性蛋白質進行 SDS-PAGE分析,用相機拍照并用Bandscan5.0軟件分析所得到的電泳圖譜如圖 4所示。

圖 4 大鯢可溶性蛋白的 SDS-PAGE電泳圖譜

對大鯢可溶性蛋白質進行 S DS-PAGE電泳分析圖譜顯示,大鯢可溶性蛋白質亞基分子量位于 121～5kDa范圍內,共有 14條帶,分子量分別為 121、93、78、67、41、35、29、19、18、14、12、9、6、5kDa,皆為低分子量的蛋白。其中分子量為 41kDa的蛋白含量最多,分子量為 35kDa和 93kDa的蛋白含量也較多。

3 結論

3.1 通過對影響大鯢蛋白溶出量的超聲提取時間、提取溫度和液料比進行了均勻設計實驗,結果表明:液料比對蛋白溶出量的影響最大,其次為溫度和時間。最佳制備工藝條件為:提取溫度 45℃,時間30min,液料比為 10∶1。

3.2 SDS-PAGE電泳圖譜顯示,大鯢可溶性蛋白組分種類較多,營養價值高,其分子量較小,有利于人體對蛋白質的消化吸收,是一種優質的營養蛋白。

[1]中國野生動物保護協會,費梁 .中國兩棲動物圖鑒[M].鄭州:河南科學技術出版社,1999:38-40.

[2]高士賢,戴定遠,范勤德 .常見藥用動物[M].上海:上海科技出版社,1984:14.

[3]喬志剛,等 .中國大鯢消化系統 13種器官的蛋白水解酶種類和活性分析[J].動物學報,2003,49(4):537-539.

[4]方開泰 .均勻設計與均勻設計表[M].北京:科學出版社, 1994:25-78.

[5]郭堯君 .蛋白質電泳實驗技術 [M].北京:科學出版社, 1999:112-158.

[6]余冰賓 .生物化學實驗指導[M].北京:清華大學出版社, 2004:136-138.

[7]Laemmli K.Cleavage ofstructural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J].Nature,1970,227 (259):680-685.

Preparation and SDS-PAGE analysis of soluble protein of Andrias davidianus

CHEN Y i-b in,MA Xiao-yan＊
(College ofLife Science and Engineering,ShaanxiUniversity of Science and Technology,Xi’an 710021,China)

U ltrasonic m e thod was used to extrac t the solub le p rote ins of And rias david ianus,and w ith a s imp le fac tor exp e r im ent and a uniform des ign,the p rep a ra tion p rocedures we re inves tiga ted.The results showed tha t the op t im a l extrac tion temp e ra ture,t im e,and the ra tio ofwa te r to m a te ria lwe re45℃,30m in and10∶1,resp ec tive ly,and the content of solub le p rote ins in And rias dab id ianus could reach63.57m g/g.SDS-PAGE ana lys is showed tha t the subunitm olecula rwe ight of solub le p rote ins was in a w ide range,which we re a lso low and easy to be absorbed.

And rias david ianus solub le p rote in;SDS-PAGE

TS254.1

A

1002-0306(2010)04-0296-03

2009-05-12 ＊通訊聯系人

陳易彬 (1955-),男,本科,副教授,研究方向:天然產物的分離與修飾。