紫山藥多糖酶法提取工藝優化研究

汪財生,孫安吉,王忠華,游廣宇

(浙江萬里學院生物與環境學院,浙江寧波 315100)

紫山藥多糖酶法提取工藝優化研究

汪財生,孫安吉,王忠華,游廣宇

(浙江萬里學院生物與環境學院,浙江寧波 315100)

采用正交實驗優選紫山藥多糖傳統熱水浸提法工藝參數,并在此基礎上進行纖維素酶法提取紫山藥多糖工藝參數研究,結果表明,傳統水浸提法最佳工藝參數為溫度80℃,提取時間 160min,加水倍數60mL/g,粗多糖平均得率為5.65%;纖維素酶法提取最佳工藝參數為水提溫度 40℃、pH5、加酶量 0.50%,粗多糖平均得率為 8.51%,較熱水浸提法提高了 1.51倍。因此,纖維素酶法工藝更適用于紫山藥多糖的提取。

紫山藥,多糖,纖維素酶

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫山藥 2007年 11月購于浙江省臺州市杜橋農貿市場,挑選當年采收,新鮮無腐爛,自然晾干的塊狀“糊蘆”根莖,將紫山藥洗凈,去皮切成約 3mm的薄片,于 60℃鼓風干燥箱下烘干,萬能粉碎機粉碎過 80目篩后保存于二氧化硅干燥器備用;纖維素酶 酶活力≥30U/mg,浙江微生物試劑有限公司;無水乙醇、苯酚、濃硫酸等 均為分析純。

UV240紫外可見分光光度計 日本島津;RE52-4旋轉蒸發器 上海瀘西分析儀器廠有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 傳統熱水浸提法工藝流程 紫山藥粉末→按比例加入蒸餾水浸提 2h→熱水浸提→4000r/min,離心 8min→沉淀再提取→合并提取上清液→真空減壓濃縮→去蛋白→60%乙醇沉淀→復溶后 95%乙醇洗滌,重復三次→無水乙醇洗滌沉淀多糖→低溫減壓干燥→紫山藥粗多糖

1.2.2 纖維素酶法水提紫山藥多糖工藝流程 紫山藥粉末按傳統熱水浸提法正交優化的加水倍數加入蒸餾水浸提 2h,加入纖維素酶,在傳統熱水浸提法正交優化的時間內按設計溫度酶解后,4000r/min,離心8min,棄沉淀,上清液真空減壓濃縮,后續操作同 1.2.1。

1.2.3 多糖含量的測定 準確稱取一定量粗多糖樣品,以葡萄糖為標準品 (用 0.9的系數校正),采用苯酚一硫酸比色法測定多糖總量[3],得回歸方程 C= 0.0242A+0.0039,R2=0.9989,多糖測定方法有效,同一樣品用 DNS比色法測定還原糖[4],得回歸方程Y=3.0176X-0.0408(R2=0.9993),還原糖測定方法有效。

多糖含量 =總糖含量-還原糖含量

紫山藥多糖得率(%)=多糖含量(g)/紫山藥粉末質量(g)×100%

2 結果與分析

2.1 傳統水提法工藝參數

2.1.1 影響傳統水提法的單因素實驗 紫山藥粉末各 50g于燒杯中,在傳統熱水浸提法設計工藝基礎上,以紫山藥多糖得率為指標進行單因素實驗分別考察各因素對傳統熱水浸提紫山藥多糖的影響,即水浴溫度 (50、60、70、80、90℃)、提取時間 (80、120、160、200、240min)、加水倍數 (20、40、50、60、70、80mL/g)。結果如圖 1所示,多糖得率隨水浴溫度升高而呈現緩慢升高趨勢,至 80℃時多糖得率達4.78%,以后趨于平緩,表明一定的水浴溫度對紫山藥多糖的提取有一定的影響,紫山藥細胞壁膨脹破裂,加速了多糖的溶出;由圖 2可知,水浴提取時間越長多糖得率越高,提取 120、160、200min的多糖得率分別為 5.38%、5.90%、5.79%,提取一定時間后該種方法對多糖的提取已基本完全,為了用較少的時間和人力資源,得到豐富的可供分析的實驗數據,故后續實驗確定其最佳浸提時間為 160min;由圖 3可看出,隨著加水倍數的增大,多糖得率呈現上升趨勢,至加水倍數為 60mL/g時出現峰值,多糖得率為5.13%,之后隨加水倍數增大,造成濃縮操作中多糖損失,多糖得率略有平緩下降。

圖 1 熱水浸提法溫度對多糖得率的影響

圖 2 水提法時間對多糖得率的影響

圖 3 熱水浸提法加水倍數對多糖得率的影響

2.1.2 正交實驗設計確定傳統水提法工藝 在上述2.1.1單因素實驗結果基礎上,采用三因素三水平L9(33)的正交實驗設計優化傳統水提紫山藥多糖的工藝參數,根據因素水平分組實驗,每組稱取紫山藥粉 10g,按設計工藝提取多糖,結果見表 1。

表 1 水提法L9(33)正交優選設計及結果

正交實驗方差分析表明,從極差結果得出影響傳統水浸提取因素大小依次為 RA＞RB＞RC,即為水浴溫度 ＞提取時間 ＞加水倍數。表 2方差分析表明溫度因素對水提法提取紫山藥粗多糖影響極顯著(P≤0.01);時間、加水倍數因素對水提法提取紫山藥粗多糖影響不顯著。因此,最佳提取條件為A2B2C2,即溫度 80℃,提取時間 160min,加水倍數60mL/g為最佳提取條件。

2.2 纖維素酶解水提法工藝參數

2.2.1 酶解水提法的單因素實驗 稱取紫山藥粉末各 50g于燒杯中,參考文獻[5-6]報道及在傳統熱水浸提法正交實驗設計最佳工藝的基礎上,以紫山藥多糖得率為指標進行單因素實驗分別考察各因素對酶解水提紫山藥多糖的影響,即酶解溫度 (30、40、50、60、70℃)、pH(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)、加入山藥干重酶量 (0.40%、0.45%、0.50%、0.55%、0.60%)。結果如圖 4所示,多糖得率隨酶解溫度升高而呈現緩慢升高趨勢,至 40℃時纖維素酶活力表現最強,多糖得率達 8.19%,之后隨溫度升高而有顯著下降趨勢;研究pH對酶解法提取紫山藥粗多糖的影響。由圖5可知,pH4.5時纖維素酶活力表現最強,多糖得率達6.94%,之后隨pH升高而有顯著下降;酶量對提取紫山藥粗多糖的影響如圖 6所示,隨著加酶量的增加,多糖得率顯著升高,當酶量達到 0.50%時多糖得率達7.96%,之后趨向平穩,多糖得率變化不明顯,表明一定的酶量已完全將山藥細胞壁酶解。酶量、溫度、pH單因素實驗結果表明與纖維素酶活力特征相符合。

表 4 纖維素酶法水提多糖正交實驗方差分析結果

表 2 水提法正交實驗的方差分析結果

圖4 酶解溫度對多糖得率的影響

圖5 酶解pH對多糖得率的影響

圖6 加酶量對多糖得率的影響

2.2.2 正交實驗設計確定纖維素酶法水提工藝參數

為了與傳統水提比較,纖維素酶解在浸提過程中,在 2.2.1單因素實驗結果基礎上,采用三因素三水平L9(33)的正交實驗設計優化酶解水提紫山藥多糖的主要工藝參數,根據因素水平分組實驗,每組稱取紫山藥粉 50g,按設計工藝提取多糖,結果見表 3。

表 3 纖維素酶法水提多糖L9(33)正交優選設計及結果

正交實驗極差分析發現,由極差 R得出影響因素大小順序為 A＞C＞B。表 4方差分析表明溫度因素對酶解提取紫山藥粗多糖影響極顯著 (P≤0.01); pH、酶量因素對提取紫山藥粗多糖影響不顯著。由此得出最佳提取工藝為A2B2C2,即在酶法提取紫山藥粗多糖時選擇最佳條件為 40℃、pH5、酶添加量為0.50%。

2.3 兩種提取方法比較

圖7 熱水浸提法與纖維素酶法提取紫山藥粗多糖、還原糖得率的比較

按上述傳統水提及纖維素酶解正交實驗結果條件下,重復 1.2.1及 1.2.2步驟提取紫山藥粗多糖,結果如圖 7所示,傳統熱水浸提法平均粗多糖得率為5.65%,纖維素酶解水提法粗多糖得率為 8.51%,酶解法比水提法多糖得率顯著提高 50.62%(P≤0.01),而還原糖量未有明顯變化。表明紫山藥細胞壁的主要成分是纖維素,恰當地利用纖維素酶處理,可使細胞壁軟化、膨脹和崩潰,從而可改變細胞壁的通透性,提高細胞內含物(蛋白質、淀粉、糖等)的提取率。提示紫山藥多糖以酶法提取為佳,而且省略熱水浸提步驟,減少了提取工藝中能耗。

3 結論

本實驗研究表明,傳統熱水提法最佳提取工藝參數為溫度 80℃,提取時間 160min,加水倍數 60mL/ g;纖維素酶法最佳提取工藝參數為溫度 40℃、pH5、酶量 0.50%。纖維素酶法提取紫山藥粗多糖的提取率比熱水法浸提的粗多糖得率提高了 1.51倍,而且所提取的紫山藥粗多糖色澤為灰白色,質量佳,纖維素酶可用來提取紫山藥多糖。用纖維素酶法提取得到的紫山藥粗多糖,由于濾渣中還有殘余的多糖,通過增加提取次數及在水浸提前加入催化劑 (如ZnCl2、MgCl2)作用下對原料進行酶預處理,還可提高多糖得率。

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[3]蕭能庚,余瑞元,袁明秀,等 .生物化學實驗原理和方法[M].北京：北京大學出版社,2005：194-196.

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Study on optimization of enzymatic extration polysaccharide from purple yam

WANG Ca i-sheng,SUN An-ji,WANG Zhong-hua,YOU Guang-yu
(College ofBiological and Environmental Sciences,ZhejiangWanliUniversity,Ningbo 315100,China)

Based on theeffec t on thec rude p olysaccha rideextrac ted by wa te r trea tm ent a t the orthogona l exp e r im ent in p urp le yam,the extrac tion cond itions of ce llulose enzym e m e thod was a lso inves tiga ted in this s tudy.The results showed tha t the op t im um extrac ting cond ition of d iffe rent m e thod was as follows：ba thing temp e ra ture a t80℃,extrac tion t im e for160m in,the ra tion of solid to liquid1∶60in the wa te r ba thing m e thod and ce llulose am ount of0.50%,the ba thing temp e ra ture a t40℃,pH va lue of5.0in the ce llulose enzym e m e thod.Unde r these two cond itions,the p olysaccha ride extrac tion ra te was 5.69% and 8.51%,resp ec tive ly.The ra te of p olysaccha ride extrac ted by ce llulose enzym e m e thod was1.51t im es of tha t extrac ted by the wa te r trea tm ent m e thod.The refore,the ce llulose enzym e m e thod is m ore suitab le for the extrac tion of p olysaccha ride from p urp le yam.

p urp le yam;p olysaccha ride;ce llulose enzym e

TS201.2

B

1002-0306(2010)02-0266-04

多糖廣泛存在于許多動植物體內,不僅是生物的營養成分,而且還參與多種生命活動。隨著人們對傳統中藥研究的不斷深入,陸續有一批從植物中提取的活性多糖成分被發現,而且已經研究表明,植物中分離得到的多糖類物質能激活免疫細胞,誘發產生許多能提高機體免疫能力的重要細胞因子,從而起到抗腫瘤、抗炎癥、抗感染及抗衰老等作用[1]。因此,活性多糖提取及功效研究已經成為生物醫藥研究的重要內容之一。紫山藥,也稱紫山芋,屬薯蕷科植物薯蕷 (D ioscorea oppositathunb)的干燥根莖;我國云南、貴州、江蘇、浙江、河南等地都有大面積種植。紫山藥含有大量的蛋白質、多糖及淀粉等較高營養物質。據《本草綱目》記載,有滋肺益腎,健脾止瀉,對脾虛腹瀉、久痢不愈、虛癆咳嗽、腎虛遺精、小便頻繁等有一定的食療作用,且食味鮮美[2]。日本、臺灣等地從國內引進后,已有紫山藥活性成分提取及開發的產品,如保健飲料、保健膠囊等產品,而我國對紫山藥開發尚屬空白,尤其是紫山藥主要活性多糖成分提取及功效未曾有文獻報道。筆者對紫山藥營養成分、薯蕷皂苷前期研究 (另文報道)時,發現紫山藥活性多糖具有很強的抗氧化功能,而且含量豐富。酶工程技術是近年來用于天然植物有效成分提取的一項生物工程技術,而國內外將酶用于紫山藥多糖提取迄今未見報道。本研究將纖維素酶用于紫山藥多糖的提取,以粗多糖得率為定量指標,先將酶法與傳統熱水浸提方法進行比較,并進一步采用正交實驗法對酶法提取工藝進行優選,為制定科學、經濟的生產工藝提供參考。

2009-03-18

汪財生(1969-),男,高級實驗師,研究方向：活性物質提取分離。