Sephadex G-50純化生姜蛋白酶的研究

杜新永,唐曉珍

(1.山東農業大學食品科學與工程學院,山東泰安 271018; 2.山東省青州市農業局,山東青州 262500)

Sephadex G-50純化生姜蛋白酶的研究

杜新永1,2,唐曉珍1,＊

(1.山東農業大學食品科學與工程學院,山東泰安 271018; 2.山東省青州市農業局,山東青州 262500)

采用 Sephadex G-50為填料對粗提生姜蛋白酶進行了純化,充分利用了尺寸排阻層析簡便、高效、重復性好的特點,以酶得率、純化倍數、柱效分析等參數為指標,研究了凝膠柱床高度、洗脫速度、上樣量等條件對純化效果的影響。確定了最佳純化方案為：柱床高度 50cm,上樣量 3mL粗酶,流速 45cm/h,洗脫液總用量 150mL。純化后的生姜蛋白酶比活性是姜汁的 4.192倍,粗酶的 2.113倍,而且還去除了色素、不溶物等雜質,純化效果極佳。

生姜蛋白酶,Sephadex G-50(葡聚糖凝膠),尺寸排阻層析(SEC),純化

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生姜 購自山東泰安當地超市;Sephadex G-50 Wha tman(進口分裝);酪蛋白、酪氨酸、BSA(牛血清蛋白)、Coomassie Blue G-250 上海化學試劑采購供應站進口分裝;其它為實驗室常規試劑。

恒流泵、紫外檢測儀、分部收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司;層析柱 上海亞榮生化儀器公司,16×500mm;分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生姜蛋白酶粗酶制備[1-4,7]生姜洗凈切絲→1∶1 (m/v)磷酸緩沖液 (pH6.86,50mmol/L,含 5mmol/L EDTA, 10mmol/L Cysteine)→打漿,低速攪拌 30min,并加入 20% (m/v)的硫酸銨→紗布過濾,4℃靜置 3h→離心,收取上層姜汁→1∶1(v/v)預冷丙酮 (-18℃)沉淀→離心獲得粗酶

1.2.2 Sephadex G-50純化[4-5]

1.2.2.1 緩沖液選擇 選擇不同緩沖液,先用 1～2倍柱體積(CBV)量平衡凝膠柱,測定收集器流出的洗脫液 pH與所用緩沖液的 pH相等后,再上樣并進行洗脫,根據 SEC純化酶的酶活力來選擇最佳緩沖液作為洗脫液。

1.2.2.2 凝膠柱床高度確定 選擇不同凝膠柱床高度,取等量粗酶上柱洗脫,根據蛋白質分離效果確定最佳凝膠柱床高度。

1.2.2.3 洗脫速度確定 設定不同洗脫速度,對 SEC進行洗脫,根據洗脫效果,確定最佳洗脫速度。

1.2.2.4 上樣量確定 在最佳柱床高度及洗脫速度時,設定不同的上樣量,綜合分離柱效與生產量來確定最佳上樣量。

1.2.2.5 純化倍率計算 分別以姜汁、粗酶的比活力與 SEC最佳純化工藝獲得的酶比活力進行比較,得出純化倍率。計算公式為：R=SE/SJ

其中：R—純化倍率;SE—酶液比活力,單位：U/μgPr;SJ—姜汁比活力,單位：U/μgPr。

1.2.2.6 蛋白質分辨率計算公式 Rs=[2(VR2-VR1)]/(Wb1+Wb2)

其中：VR1和 VR2—峰 1和峰 2的洗脫體積;Wb1和Wb2—洗脫峰 1和峰 2的峰寬。

分離效率計算基準為：Rs=1.5時,分離效率為100%;Rs=1.0時,分離效率為 98%,以此為基準,推測出其他分辨率所對應的分離效率。

1.2.3 測定方法

1.2.3.1 蛋白質含量的測定[8]本實驗采用 Bradford Protein Assay(考馬斯亮藍 G-250)法測定蛋白質含量。標準曲線方程為：y=202.41x-2.3252,R2= 0.9912,單位：μg/mL。

1.2.3.2 生姜蛋白酶活力測定[1,8]生姜蛋白酶活力的定義：在 40℃水浴條件下,酶促反應前 5min降解酪蛋白產生 TCA(三氯乙酸)可溶的多肽增加量,以活性與滅活的生姜蛋白酶進行對照,根據酪氨酸標準方程,每增加 1μg/mL酪氨酸的值計量為一個酶活力單位。標準方程為：y=802.92x-9.5212,R2= 0.9995,單位：U。

2 結果與分析

2.1 緩沖液的選擇

采用磷酸 (pH6.86,0.05mol/L)、Tris-HCl (pH8.0,0.05mol/L)、去離子水(pH 7.0,無緩沖能力)三種緩沖液對生姜蛋白粗酶進行純化,從而得到不同緩沖液的生姜蛋白 SEC純化酶液。以酪蛋白為底物分別設定酶促水解反應時間：5、25、50、100、150min,根據標準方程計算酪蛋白酶促水解量,結果見圖1。

圖 1 不同緩沖液中生姜蛋白酶活力比較

從圖 1可以看出,隨著酶促水解時間的延長,酪蛋白水解量呈上升趨勢,50min前水解量增長較快,之后漸漸變緩。其中,磷酸緩沖液 (pH6.86)SEC純化酶的酪蛋白水解量上長趨勢較明顯,而 Tris-HCl (pH8.0)與去離子水(pH7.0)SEC純化酶的酪蛋白水解量上升趨勢較為平緩,隨著時間的延長,酪蛋白水解量并沒有明顯的增長。本實驗設定的酶促反應溫度為 40℃,在該溫度下,生姜蛋白酶半衰期僅為20min[9],而磷酸緩沖液 (pH6.86)SEC純化酶的酪蛋白水解量在 50min內一直呈現出明顯的增長趨勢,說明磷酸緩沖液(pH6.86)能較好地保持生姜蛋白酶的活性。

比較三種 SEC純化酶的酪蛋白水解量,除 5min的值以去離水(pH7.0)SEC純化酶最高外,其余各個時間點的酪蛋白水解量均為：磷酸緩沖液 (pH6.86)酶 ＞去離子水(pH7.0)酶 ＞Tris-HCl(pH8.0)酶。

綜合上述分析,磷酸緩沖液 (pH6.86)是最佳的選擇,故本實驗確定磷酸緩沖液 (pH6.86)為生姜蛋白酶 SEC洗脫液。

2.2 Sephadex G-50凝膠柱床高度確定

SEC在洗脫液推動下,利用分子量不同的物質受到凝膠阻力不同,導致移動速度不同而被分離[5],因此凝膠柱床高度是一個重要的柱效指標。本實驗選擇凝膠柱床高度 25、50cm兩個高度進行純化操作,當凝膠柱床高度為 25cm時,采用恒流泵將洗脫速度分別設定為 2.0、0.5、1.5mL/min的速度進行洗脫,上樣量為 70μg/mL的粗酶 2mL(10g生姜制得)時,只能獲得一個蛋白峰 (見圖 2),而將凝膠重新裝柱到 50cm后,確定 1.5mL/min的洗脫速度,分別上樣量為粗酶 2、3、4、10mL(相當于 10、15、20、50g生姜制得)時,則可以得到兩個很明顯的蛋白洗脫峰 (見圖3)。

生姜蛋白粗酶在提取、沉淀等過程中,以姜汁中蛋白質為目標物,因此,粗酶中雜蛋白含量較大,在SEC純化過程中,獲得一個蛋白峰就意味著雜蛋白去除量極少,而獲得兩個蛋白峰就說明至少去除了約一半的雜蛋白。對比圖 2、圖 3可以明顯地看到,將凝膠柱床高度從 25cm提高到 50cm后,粗酶中的蛋白質分離度得到了明顯的提高。本實驗中采用的層析柱最高僅能裝 50cm凝膠,故而確定凝膠柱床高度 50cm。

圖2 25cm凝膠柱床洗脫效果圖

圖3 50cm凝膠柱床洗脫效果圖

2.3 洗脫速度確定

從圖 2可以看出,洗脫速度越快,蛋白質出峰越快,然而分離效果較差。當凝膠柱床高度增高到50cm后,重復上述洗脫速度的實驗,當洗脫速度超過 1.5mL/min后,就不能得到兩個明顯的蛋白峰,達到 3.0mL/min的洗脫速度后,最終的洗脫效果就僅出現一個蛋白峰。

分析對比所有的實驗數據后,最終確定1.5mL/min為最佳洗脫速度,此速度可以獲得最佳洗脫效果。

洗脫速度換算結果[5]為：(60×1.5mL/h)/ (100mL/50cm)=45cm/h

2.4 上樣量確定

從圖 3可以看出,上樣量越大,出峰越快,峰形越高,但是兩峰之間的分離效果也越差,分別計算圖3中四個處理的分辨率 (見表 1)。

表1 SEC不同上樣量柱效表

從表 1中可以看出,當上樣量高于 15g生姜制取的粗酶后,分離效率就不夠理想,因此,可以確定上樣量為 15g生姜制粗酶 (用 1∶3v/v磷酸緩沖液復溶, 3mL)時,可以獲得較好的分離效果。

2.5 純化倍率計算

分別取姜汁、粗酶、SEC純化酶測定蛋白質含量、酶活力單位、比活力,以姜汁、粗酶的比活力為 1,測算出生姜蛋白酶的純化倍率,其結果見表 2。

從表 2可以看出,以姜汁酶活力為基準時,粗酶的比活力為其 1.98倍,而經過 SEC純化后,比活力純化倍數達到 4.19倍,是粗酶的 2.11倍,純化效果比較理想。

表2 SEC純化效果表

3 結論

3.1 本實驗結果證明,單獨使用 Sephadex G-50為填料進行 SEC純化,就能夠有效地純化生姜蛋白酶,純化倍率是姜汁的 4.19倍,是粗酶的 2.11倍。而且其純化過程簡便、高效、重復性好。

3.2 SEC純化不僅可以除去粗酶中絕大部分的色素、不溶物等雜質,還可以更換緩沖液,能夠適應研究、生產時對生姜蛋白酶緩沖液的特殊需要。

3.3 通過實驗,確定了 Sephadex G-50純化生姜蛋白酶的最佳洗脫方案為磷酸 (pH 6.86)緩沖液,柱床高度 50cm,上樣量 3mL(15g生姜提取的粗酶),流速45cm/h,洗脫液總用量 150mL。

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Study on purification of ginger protease by Sephadex G-50

DU Xin-yong1,2,TANG Xiao-zhen1,＊
(1.Food Science and Engineering College of ShandongAgriculturalUniversity,Taian 271018,China; 2.Qingzhou CityAgriculturalBureau of Shandong Province,Qingzhou 262500,China)

C rude g inge r p rotease was p urified by Sep hadex G-50,and the op t im a l p urifica tion m e thod was ob ta ined through resea rches about the ge l bed leng th,flow ra te,samp le app lica tion am ount,and was m easured by g inge r p rotease yie ld,p urified folds,and the effic iency of chrom a tog rap hy colum n.The p a ram e te rs we re：ge l bed leng th—50cm,samp le app lica tion am ount—c rude g inge r p rotease3mL (extrac ted from 10g g inge r),flow ra te—45cm/h,and the tota l e lution leng th was150mL.Afte r p urifying,not only the sp ec ific ac tivity of p urified g inge r p rotease inc reased to4.192folds of g inge r juice,and2.113folds of c rude g inge r p rotease,but a lso p igm ent, insolub le imp urities we re rem oved,which ind ic ts a good effec t of p urifica tion.

g inge r p rotease;Sep hadex G-50;s ize exc lus ive chrom a tog rap hy(SEC);p urifica tion

TS255.1

A

1002-0306(2010)03-0303-03

生姜蛋白粗酶的純化常用離子交換層析 (I on Exchange Chromatography)、尺寸排阻層析 (Size Exclusive Chromatography,SEC)[1-4]等柱層析法進行純化,其特點是樣品處理量大,效率較高。對需要較高純度的生姜蛋白酶時,則使用 HPLC[1]、電泳[2]等方法。尺寸排阻層析(SEC),又稱為凝膠過濾層析(Gel Filtration Chromatography,GFC),其純化原理是利用具有多孔網狀結構凝膠的分子篩作用,根據被分離樣品中各組分分子量大小的差異對樣品進行分離[5]。因為 SEC所用的凝膠屬于惰性載體,不帶電荷,吸附力弱,所以具有易清洗、可更換緩沖溶液等優點。在現有的文獻報道中,SEC一般用于離子交換層析(IEC)之后[4],也就是使用 SEC對 IEC純化酶作進一步的純化,或使用 SEC檢測樣品的分子量[6],還未有單獨使用 SEC對生姜蛋白酶進行純化的報道。與IEC相比,SEC具有操作簡便、高效、重復性好、回收率高等優點,在純化的過程中,還可以更換緩沖液,便于根據工業生產的需要設定相應的純化方案。本實驗采用 Sephadex G-50為填料對生姜蛋白粗酶進行純化,獲得了較好的純化效果。

2009-05-21 ＊通訊聯系人

杜新永(1973-),在讀碩士。