甘木通不同部位總黃酮含量的測(cè)定

胡宗禮，黃曉萍，陳珺霞

（韶關(guān)學(xué)院英東生物工程學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005）

甘木通不同部位總黃酮含量的測(cè)定

胡宗禮*，黃曉萍，陳珺霞

（韶關(guān)學(xué)院英東生物工程學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005）

目的：建立黃酮類化合物含量的測(cè)定方法并分別測(cè)定甘木通莖、葉中總黃酮含量。方法以蘆丁為對(duì)照品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以75%乙醇為溶劑在90℃加熱回流提取甘木通莖、葉中總黃酮類成分，用分光光度法在波長(zhǎng)510nm處測(cè)定總黃酮含量。結(jié)果蘆丁濃度（C）與吸光度（A）間的關(guān)系為C＝0.090 244A－0.000 193 6（r＝1.000 0），回收率為101.18%，RSD＝2.36%（n＝5）。甘木通莖和葉中總黃酮含量分別為0.99%和1.20%。結(jié)論甘木通葉中總黃酮含量比莖約高出21%。

甘木通；總黃酮；分光光度法

甘木通Clematis filamentosa Dunn俗稱眼蛇藥，為毛茛科絲鐵線蓮屬植物，主要分布在廣東、廣西、海南、云南等地，在粵北乳源山區(qū)有較為豐富的野生資源，對(duì)心血管疾病（冠心病、高血壓）有顯著療效［1］。目前關(guān)于甘木通確切的有效成分尚不清楚，其提取物經(jīng)鹽酸鎂粉反應(yīng)及硝酸鋁反應(yīng)均呈陽性，提示甘木通含有黃酮類成分。大量研究證實(shí)黃酮類化合物具有抗心肌缺血、降血壓、抗心律失常等功效［2］，結(jié)合甘木通及其制劑的臨床應(yīng)用，甘木通中黃酮類化合物是其有效成分之一，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)甘木通不同部位進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定，為甘木通藥用部位的選定提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材與試藥

甘木通藥材（廣東雷霆國(guó)藥有限公司），采收于2007年10月，經(jīng)韶關(guān)市藥品檢驗(yàn)所江蘭英所長(zhǎng)鑒定為甘木通Clematis filamentosa Dunn；蘆丁對(duì)照品（上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度為98%）；無水乙醇、石油醚、醋酸乙酯、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等均為分析純。

1.2 主要儀器

JA5033型電子分析天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；725N型紫外可見光分光光度計(jì)（上海科學(xué)精密儀器有限公司）；101-1B型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 線性考察

精密稱取120℃下干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品15.00mg，置于100mL容量瓶中，加75%乙醇適量溶解后，加75%乙醇定容至刻度，搖勻，即得每1mL含無水蘆丁0.15mg的對(duì)照品溶液。精密量取0.0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0mL蘆丁對(duì)照品溶液，分別置于10mL容量瓶中，補(bǔ)充75%乙醇至5mL，搖勻；加5%亞硝酸鈉溶液0.1mL，搖勻放置6min；加入 10%硝酸鋁溶液 0.3mL，混勻放置6min；加入10%氫氧化鈉溶液4.0mL，用去離子水補(bǔ)加至刻度，充分搖勻，在顯色后15min以蘆丁空白為對(duì)照，于檢測(cè)波長(zhǎng)510nm處測(cè)定吸光度值。結(jié)果采用最小二乘法，以蘆丁濃度（C）－吸光度（A）進(jìn)行直線回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程C＝0.090 244A－0.000 193 6，在蘆丁濃度為0.007 5～0.06mg·mL－1線性關(guān)系良好（r＝1.000 0）。

2.2 精密度試驗(yàn)

精密量取0.5，2.0，4.0mL蘆丁對(duì)照品溶液各3份，分別置于10mL容量瓶中，按 “線性考察”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算SD和RSD。結(jié)果用分光光度法測(cè)定不同濃度的蘆丁含量，其SD和RSD均較小，尤其是在高濃度時(shí)，說明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)精確，見表1。

表1 蘆丁精密度試驗(yàn)

2.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

精密量取0.5，2.0，4.0mL蘆丁對(duì)照品溶液各3份，分別置于10mL容量瓶中，分3組按 “線性考察”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度值，計(jì)算SD和RSD，結(jié)果顯示重現(xiàn)性良好，見表2。

表2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的重現(xiàn)性試驗(yàn)

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取0.5，2.0，4.0mL蘆丁對(duì)照品溶液和1.0mL供試品溶液各3份，分別置于10mL容量瓶中，蘆丁對(duì)照品溶液和同一供試樣品溶液在反應(yīng)體系形成黃酮 －鋁鹽絡(luò)合物后0，10，20，30，40，50，60，80，100，120min，按 “線性考察”項(xiàng)下方法測(cè)定其吸光度。結(jié)果顯示在30min內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD＝0.12%，30min后吸光度逐漸下降且變化明顯，提示測(cè)定宜在反應(yīng)顯色后30min內(nèi)進(jìn)行，本實(shí)驗(yàn)選擇測(cè)定時(shí)間為反應(yīng)顯色后15min。同時(shí)吸取同一供試品溶液1.0mL分別在制備后0，1，2，3，4，6，8h，按 “線性考察”方法測(cè)定總黃酮含量，結(jié)果RSD＝1.84%，表明供試品溶液在8h內(nèi)基本穩(wěn)定，測(cè)定結(jié)果無顯著變化。

2.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取5份已測(cè)定總黃酮含量的甘木通葉提取液供試品各1.0mL，置于10mL容量瓶中，依次加入蘆丁對(duì)照品溶液 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0mL，按 “線性考察”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算加樣回收率與RSD，結(jié)果見表3。

表3 蘆丁加樣回收試驗(yàn)

2.6 樣品含量測(cè)定

取適量甘木通莖、葉，在40℃下烘干至恒重，粉碎，分別精確稱取5.0g藥材粉末放入燒瓶中，用適量石油醚加熱回流直至無色，棄去石油醚提取液，于溫水浴中揮干殘留的石油醚，然后加100mL75%乙醇于90℃回流提取1h，過濾，殘?jiān)?00mL75%的乙醇繼續(xù)提取3次，合并4次濾液減壓濃縮，用醋酸乙酯萃取3次，萃取液回收醋酸乙酯后轉(zhuǎn)移至100mL的容量瓶中，加75%乙醇定容即得供試品溶液。精密量取甘木通葉與莖的供試品溶液1.0mL（各3份）分別置于10mL容量瓶中，按 “線性考察”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算葉、莖中總黃酮的平均含量，結(jié)果見表4。

表4 甘木通葉與莖的總黃酮含量

甘木通葉、莖中總黃酮含量分別為11.976mg·g－1（1.20%）與9.894mg·g－1（0.99%），盡管葉比莖的總黃酮含量高出約21%，但二者均可入藥。

3 討論

大量研究表明黃酮類化合物因具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、降血壓、降血脂、抑制血小板聚集、降低血管脆性、抗菌、抗癌等作用而引起人們的高度重視［2］。分析測(cè)定黃酮類化合物的方法有許多，而目前應(yīng)用最廣的方法仍是HPLC法和分光光度法。HPLC法具有分離效率高、分析速度快、檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但設(shè)備昂貴、操作要求高。采用反相HPLC法時(shí)由于黃酮類化合物未解離的羥基與固相作用較強(qiáng)而導(dǎo)致拖尾，加酸雖然可以克服拖尾現(xiàn)象，但是酸對(duì)儀器具有腐蝕性［3］。分光光度法根據(jù)黃酮類化合物與Al3＋絡(luò)合顯色的原理進(jìn)行分析測(cè)定，所用設(shè)備簡(jiǎn)單、操作容易，特別適合測(cè)定總黃酮的含量［4-5］。

用甘木通藥材生產(chǎn)制劑時(shí)是莖、葉混合提取，但甘木通確切的有效部位尚不明確，以甘木通中的有效成分黃酮類化合物為檢測(cè)指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)采用分光光度法測(cè)定甘木通葉與莖中總黃酮類化合物的含量分別為1.12%和0.99%，盡管葉中總黃酮含量比莖高出21%，但是比較接近，說明莖、葉均可入藥，并可以混合在一起提取。此外，本實(shí)驗(yàn)的精密度試驗(yàn)和回收率試驗(yàn)均較好，在甘木通確切的有效成分尚不明確而缺乏質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的情況下，該方法暫可用于甘木通藥材及其制劑的質(zhì)量控制。

［1］傅銳斌，邱建，馬俊，等.冠心康片治療冠心病心絞痛臨床療效研究［J］.中藥材，2005，28（11）：1045-1046.

［2］許實(shí)波，梅雪婷，許東暉，等.26種黃酮類天然活性成分的藥理研究進(jìn)展［J］.中藥材，2003，26（1）：46-54.

［3］趙曉莉，岳紅.黃酮類化合物分析方法概述［J］.鹽湖研究，2005，13（2）：34-38.

［4］魏永生，王永寧，石玉平，等.分光光度法測(cè)定總黃酮含量的實(shí)驗(yàn)條件研究［J］.青海大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2003，21（3）：61-63.

［5］鄧桂春，王鑫，趙麗艷，等.分光光度法測(cè)定銀杏葉中黃酮的含量［J］.遼寧大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，32（2）：101-104.

Determ ination of Total Flavonoids Contents from Leaves and Stem of Clematis Filamentosa Dunn

Hu Zongli，Huang Xiaoping，Chen Junxia
（Yingdong School of Bioengineering，Shaoguan University，Shaoguan Guangdong 512005，China）

Objective：To determinate the contents of total flavonoids from leaves or stem of Clematis filamentosa Dunn.M ethods：The total flavonoids from Clematis filamentosa Dunn were extracted with 75%alcohol at 90℃.Taking rutin as comparison product to make standard curve，the content of flavonoids was determinated by spectrophotomerty with the detection wavelength of 510nm.Results：Regression equation was C＝0.090 244A－0.000 193 6（r＝1.000 0）.The linear concentration was in the range of 0.007 5～0.060mg·mL－1for rutin.The average recovery was 101.18%，RSD was 2.36% （n＝5）.The average contents of total flavonoids from leaves or stem of Clematis filamentosa Dunn were 1.20%and 0.99%respectively.Conclusion：The total flavonoids content from leaves of Clematis filamentosa Dunn was higher over 21%than one from their stem

Clematis filamentosa Dunn；Total flavonoids；Spectrophotomerty

*胡宗禮，E-mail：sgu-hu-zl＠shou.com

2009-10-20）