黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)降血壓肽酶解液脫色工藝的優(yōu)化

代春華，馬海樂(lè)，趙圣惠，顧小紅，湯 堅(jiān)，*

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.江南大學(xué)食品科學(xué)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122）

黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)降血壓肽酶解液脫色工藝的優(yōu)化

代春華1，2，馬海樂(lè)1，趙圣惠1，顧小紅2，湯 堅(jiān)2，*

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.江南大學(xué)食品科學(xué)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122）

采用粉末活性炭對(duì)脫脂黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)降血壓肽酶解液進(jìn)行脫色處理。通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)，考察了活性炭用量、pH、溫度和吸附時(shí)間等因素對(duì)脫色率（DE）、肽損失率（LP）和溶液對(duì)血管緊張素酶（ACE）的活性抑制率（IP）的影響。結(jié)果表明，粉末活性炭用量3%，pH3，脫色溫度40℃，吸附時(shí)間50min的條件下，黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)降血壓肽酶解液脫色效果明顯，脫色率為85.3%，ACE抑制活性為70.8%。

黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)，降血壓肽，酶解液，脫色

黃粉蟲(chóng)學(xué)名：Tenebrio molitor Linne，別名大黃粉蟲(chóng)、黃粉甲，俗稱面包蟲(chóng)，是一種大型的倉(cāng)儲(chǔ)害蟲(chóng)。黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)中脂肪、蛋白質(zhì)含量高，素有“動(dòng)物蛋白飼料之王”的稱譽(yù)。長(zhǎng)期以來(lái)，由于對(duì)其缺乏系統(tǒng)的研究，因此開(kāi)發(fā)利用較少，使大量的營(yíng)養(yǎng)資源被浪費(fèi)［1-3］。為更好地開(kāi)發(fā)利用此資源，作者以脫脂黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)為原料進(jìn)行酶解制備降血壓肽，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明酶解液具有較好的降血壓效果，但黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)在酶解過(guò)程中會(huì)伴隨大量色素物質(zhì)生成，導(dǎo)致酶解液為棕黃色，影響后續(xù)的分離純化效果。因此，本研究采用生產(chǎn)中常用的粉末活性炭進(jìn)行脫色處理。以脫脂黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)酶解液為原料，以脫色率（DE）和肽損失率（LP）為指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)粉末活性炭脫色工藝條件進(jìn)行比較，在肽損失率達(dá)到要求的基礎(chǔ)上，再以脫色率和酶解液對(duì)血管緊張素酶（ACE）的活性抑制率（IP）為指標(biāo)，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)考察各因素對(duì)指標(biāo)的影響，確定黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)酶解液脫色的最優(yōu)工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)粉 由鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)恒哲生態(tài)養(yǎng)殖場(chǎng)提供，均為干燥并粉碎的樣品，水分10%，油脂30.8%，蛋白質(zhì) 42.6%［4］；Alcalase蛋白酶 丹麥NovoNordisk公司提供；FAPGG、羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES） Sigma公司；其他化學(xué)試劑 上海國(guó)藥集團(tuán)。

756 MC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；TGL-16高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀儀器有限公司；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；pHS-3TC數(shù)顯pH計(jì) 上海天達(dá)儀器有限公司；電子天平 北京賽多利斯系統(tǒng)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)降血壓肽酶解液的制備 稱取5g黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)粉裝入濾紙筒中，于索氏抽提器中以無(wú)水乙醚為提取劑回流提取4h，水浴溫度55℃。脫脂樣品于干燥箱中65℃干燥至恒重。

稱取3g脫脂黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)粉，加入70mL蒸餾水，置50℃水浴中，加入40μL堿性蛋白酶（酶活力為34萬(wàn)個(gè)單位），酶解1.5h，置沸水浴中15min使酶失活。離心、過(guò)濾、定容至100mL備用。

1.2.2 活性炭吸附脫色實(shí)驗(yàn) 向脫脂黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)酶解液中加入一定量的吸附劑，在一定的溫度、pH條件下吸附一定時(shí)間，高速離心后過(guò)濾得上清液，測(cè)其脫色率、肽損失率及溶液對(duì)ACE抑制活性。

1.2.3 脫色率和肽損失率測(cè)定 用紫外分光光度計(jì)在色素的最大吸收波長(zhǎng)處（400nm）和蛋白質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)處（280nm）分別測(cè)定溶液的吸光值，計(jì)算溶液脫色率（DE）和肽損失率（LP）［5-6］。

DE=（OD400-OD′400）/OD400×100%

其中：OD400為脫色前光吸收度；OD′400為脫色后光吸收度。

LP=（OD280-OD′280）/OD280×100%

其中：OD280為脫色前光吸收度；OD′280為脫色后光吸收度。

1.2.4 ACE抑制活性（IP）的測(cè)定 將樣品溶液稀釋20倍后，以FAPGG（FA-Phe-Gly-Gly）作為ACE的底物，測(cè)定各組分的ACE抑制活性［7］。測(cè)定在酶標(biāo)儀中進(jìn)行，按表1所示進(jìn)行測(cè)定。

表1 ACE抑制活性的測(cè)定

加樣完成后立即在340nm測(cè)定對(duì)照孔和樣品孔的初始吸光度，分別設(shè)為a1和b1，在37℃的環(huán)境中避光放置30min后再次測(cè)定在340nm的吸光度，分別設(shè)為a2和b2。對(duì)照孔的吸光度減少A=（a1-a2），樣品孔的吸光度減少B=（b1-b2），抑制率（%）=（A-B）/A×100%

ACE酶活單位定義：在 37℃、1min內(nèi)催化FAPGG形成1μmol的FAP（FA-Phe）所需的酶量。

1.2.5 正交實(shí)驗(yàn) 為獲得脫色效果較好的脫脂黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)酶解液，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)確定最佳脫色條件，以脫色率及ACE抑制活性為指標(biāo)，各因素和水平的選擇見(jiàn)表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 活性炭用量對(duì)脫色率和肽損失率的影響

將脫脂黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)酶解液的pH調(diào)至4，分別加入不同量的活性炭，在40℃下脫色40min，不同活性炭用量對(duì)酶解液脫色率和肽損失率的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著活性炭用量的增加，脫色率提高，但肽損失率也隨之增加，綜合考慮在脫色效果已達(dá)到要求的范圍內(nèi)，應(yīng)以肽損失率最小為目標(biāo)，因?yàn)殡S著肽損失率的增加有可能使溶液中的活性成分也損失掉，故活性炭用量在3%較為適宜。

圖1 活性炭用量對(duì)脫色率和肽損失率的影響

2.2 pH對(duì)脫色率和肽損失率的影響

向酶解液中加入3%的活性炭，脫色溫度為40℃，分別在不同pH下脫色40min，pH對(duì)脫色率和肽損失率的影響結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，pH對(duì)脫色率及肽損失率的影響非常明顯，活性炭在pH小于4的酸性范圍內(nèi)脫色效果明顯好，但肽的損失率也較大。綜合考慮脫色率和肽損失率兩個(gè)方面的因素，應(yīng)該在脫色效果已達(dá)到要求的范圍內(nèi)，選擇肽損失率較低的pH，故確定溶液脫色pH為4。

圖2 pH對(duì)脫色率和肽損失率的影響

2.3 脫色溫度對(duì)脫色率和肽損失率的影響

將酶解液pH調(diào)至4，加入3%的活性炭，分別在不同的溫度下脫色40min，溫度對(duì)酶解液DE和LP影響結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，隨著溫度的升高，脫色率提高，同時(shí)肽損失率也增加，綜合考慮脫色效果和肽損失率兩個(gè)因素，選擇脫色溫度50℃。

圖3 溫度對(duì)脫色率和肽損失率的影響

2.4 吸附時(shí)間對(duì)脫色率和肽損失率的影響

將酶解液pH調(diào)至4，加入3%的活性炭，于50℃分別脫色20、40、60、80、100min，酶解液脫色率和肽損失率的變化結(jié)果如圖4所示。從圖4可知看出，脫色時(shí)間為40min時(shí)，活性炭對(duì)酶解液的脫色率最高，隨后逐漸降低；肽損失率也在脫色時(shí)間為40min時(shí)達(dá)到最大值，隨著脫色時(shí)間增加，肽損失率也在不斷地下降。在肽損失率較低的情況下，選擇脫色效果較好的時(shí)間條件，因此，脫色時(shí)間以40min為宜。

圖4 吸附時(shí)間對(duì)脫色率和肽損失率的影響

2.5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

由于上述單因素實(shí)驗(yàn)中未曾考慮因素之間的交互影響，因此，在以上實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)上述四個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，由于脫脂黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)酶解液中所含的活性肽有可能被活性炭吸附，在上述單因素實(shí)驗(yàn)中用肽損失率還不能很好地反映出溶液中活性部分的保留情況。因此，正交實(shí)驗(yàn)則改用酶解液的脫色率和ACE的抑制活性為考察指標(biāo)，以確定最佳脫色條件，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表3可以看出，四個(gè)影響因素對(duì)脫色率和對(duì)ACE抑制活性的影響是不同的，活性炭在酶解液脫色的過(guò)程中，要求脫色率和溶液活性最大，本研究采用加權(quán)評(píng)分法，確定兩者的權(quán)重系數(shù)均為0.5后對(duì)兩項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)求和得到綜合評(píng)分如表4［6］。

表4 加權(quán)綜合評(píng)分結(jié)果

從加權(quán)綜合評(píng)分結(jié)果看出，溶液的pH對(duì)脫色率及ACE抑制活性的影響最為明顯，其次是活性炭用量，脫色溫度對(duì)指標(biāo)的影響最小，最佳脫色條件為：A2B1C1D2，在此條件下進(jìn)行脫色實(shí)驗(yàn)，測(cè)得脫色率為85.3%，ACE抑制活性為70.8%。

3 結(jié)論

脫脂黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)酶解液顏色較深，對(duì)其進(jìn)一步分離純化產(chǎn)生不良影響，因此必須對(duì)酶解液進(jìn)行脫色。以脫色率及肽損失率為指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)篩選出活性炭對(duì)酶解液脫色的較佳條件。再以脫色率和對(duì)ACE抑制活性為指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，得出脫色最佳條件為：粉末活性炭用量3%，pH3，脫色溫度40℃，吸附時(shí)間50min。在此實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)得酶解液的脫色率為85.3%，ACE抑制活性為70.8%。黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)降血壓肽酶解液為透明淺黃色，可直接進(jìn)行后續(xù)分離純化工作。

［1］王文亮，孫守義，王守經(jīng)，等.中國(guó)黃粉蟲(chóng)食品研究開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀及發(fā)展前景［J］.世界農(nóng)業(yè)，2007（9）：50-52.

［2］趙大軍.黃粉蟲(chóng)的營(yíng)養(yǎng)成分及食用價(jià)值［J］.糧油食品科技，2000，8（2）：41-42.

［3］楊兆芬，林躍鑫，陳寅山，等.黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)成分分析和保健功能的實(shí)驗(yàn)研究［J］.昆蟲(chóng)知識(shí)，1999，36（2）：97-101.

［4］代春華，馬海樂(lè)，顧小紅，等.黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)及蛹中營(yíng)養(yǎng)成分分析［J］.食品工業(yè)科技，2009（4）：315-317.

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［7］畢昊，劉志國(guó)，屈伸，等.米糠蛋白酶解產(chǎn)物中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的研究［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2005，34（6）：699-706.

Optimization of decolouring technology of antihypertensive peptides hydrolysate from defatted larva of Tenebrio molitor（L.）

DAI Chun-hua1，2，MA Hai-le1，ZHAO Sheng-hui1，GU Xiao-hong2，TANG Jian2，*
（1.School of Food and Biology Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Single factor and orthogonal experiments were applied to investigate the optimum conditions of decolouring of defatted larva of Tenebrio molito（rL.）hydrolysate.ln the experiments，the factors of activated carbon quantity，pH，temperature and absorption time were considered in terms of decolouring efficiency，peptide loss and inhibition percentage of angiotensin converting enzyme（ACE）activity.The results showed that optimum decoloration effect was obtained from the following conditions：quantity of activated carbon 3%，pH value 3，temperature 40℃，and adsorption time 50min，respectively.Then decolouring efficiency and inhibition percentage of ACE were 85.3%and 70.8%，respectively.

larva of Tenebrio molito（rL.）；antihypertensive peptides；hydrolysate；decolorization

TS201.1

B

1002-0306（2010）12-0261-03

2009-12-28 *通訊聯(lián)系人

代春華（1972-），女，講師，在讀博士，主要從事食品功能性因子的檢測(cè)。

鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科技項(xiàng)目（NY2008028）。