響應面法優化黃孢原毛平革菌產多糖培養基的研究

許艷艷，張朝暉

（浙江工業大學生物與環境工程學院，浙江杭州310014）

響應面法優化黃孢原毛平革菌產多糖培養基的研究

許艷艷，張朝暉*

（浙江工業大學生物與環境工程學院，浙江杭州310014）

將Plackett-Burman設計法和響應面分析法相結合，對影響黃孢原毛平革菌（Phanerchaete chrysoprium）生產多糖的發酵培養基進行優化。結果表明，培養溫度、酒石酸銨濃度和初始pH與多糖產量存在顯著的相關性，采用優化后的條件進行搖瓶發酵，得到黃孢原毛平革菌產多糖的最佳工藝條件：葡萄糖10g/L，酒石酸銨0.4g/L，大量溶液60mL/L，微量元素液25mL/L，維生素B11mg/L，初始pH4.5，發酵溫度37℃，接種量10%，非固定化培養5d。多糖產量從289.3mg/L提高到467.9mg/L。

黃孢原毛平革菌，多糖，響應面，優化

黃孢原毛平革菌（Phanerchaete chrysoprium）是白腐真菌的一種，具有發達的菌絲體。孢子表面有小桿狀結構，表面組成為蛋白質35%，糖20%，類烴物質33%。采用發酵法生產真菌提取多糖具有周期短、成本低、產量大、易于大規模生產的優點，是一種大量獲得真菌多糖的有效途徑，對真菌多糖在生命科學、醫藥科學的研究與開發有重要意義［1］。本研究試圖從黃孢原毛平革菌中提取胞外多糖，進行多糖的組成性質的研究，擴展人們對微生物來源的多糖的認識。響應面分析（Response Surface Methodology）法系采用多元二次回歸方法作為函數估計的工具，將多因子實驗中因素與指標的相互關系用多項式近似擬合，依此可對函數的響應面和等高線進行分析，研究因子與響應面之間、因子與因子之間的相互關系。它與過去廣為使用的“正交實驗設計法”不同，具有實驗周期短，求得的回歸方程精度高，能研究幾種因素間交互作用等優點［2］。本研究在單因素實驗的基礎上，利用響應面分析法對黃孢原毛平革菌多糖發酵培養基進行了優化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌種 黃 孢 原 毛 平 革 菌（Phanerchaete chrysoprium）ATCC24725；麥芽汁斜面培養基 葡萄糖8g/L，麥芽汁10g/L，蛋白胨2g/L，酵母膏2g/L，天冬氨酸1g/L，KH2PO42g/L，MgSO41g/L，維生素B11mg/L，瓊脂20g/L，NaOH調pH≥6.0；初始發酵培養基 葡萄糖 10g/L，NH4Cl 0.2g/L，大量元素液［3］60mL/L，微量元素液［3］25mL/L，維生素B11mg/L；優化后發酵培養基 葡萄糖10g/L，酒石酸銨0.4g/L，大量元素液60mL/L，微量元素液25mL/L，維生素B11mg/L。

1.2 實驗方法

1.2.1 孢子的制備 將孢子接種在上述固體培養基斜面上，30℃下培養5d，用無菌水把孢子洗出，4層紗布過濾。孢子濃度可由650nm下的吸光度來測定（當吸光度為1.0時，孢子濃度大約是5×106個/mL）。

表1 Plackett-Burman實驗設計及響應值

表2 Plackett-Burman實驗設計的因素水平及效應分析

1.2.2 培養方法 取發酵培養基100mL加入500mL錐形瓶中，121℃滅菌20min，孢子接種（每瓶接種量約3×107），置于37℃搖床培養，轉速140r/min。

1.2.3 多糖提取 將發酵所得的發酵液在熱水浴中浸提一段時間，期間不停進行攪拌，使胞外糖析出，冷卻后過濾，收集發酵液備用，采用旋轉蒸發儀進行真空濃縮，加入3倍體積的體積分數95%乙醇沉淀，盡量提高得率。選用真空冷凍干燥得到多糖。

1.2.4 分析方法 3，5-二硝基水楊酸法測還原糖［4］，苯酚-硫酸法測總糖［5］。

1.3 實驗設計

1.3.1 Plackett-Burman設計［6-7］Plackett-Burman（PB）法是一種近飽和的2水平實驗設計方法。它基于非完全平衡塊原理，能用最少實驗次數估計出因素的主效應，以從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個因素供進一步研究。

影響黃孢原毛平革菌多糖發酵的可能因素包括碳源、氮源濃度，pH、發酵溫度、培養轉速、培養時間、接種量、菌體形態等。為對這8個因素進行全面考察，選用了N=11的PB設計，并余留3個空項作誤差分析［8］。每個因素取2個水平：低水平和高水平分別用“-”和“+”符號表示。實驗設計如表1所示，各參數所代表因素及其水平見表2。

1.3.2 Box-Behnken中心組合設計［9-11］響應面分析法（response surface analysis）是一種尋找多因素系統中最佳條件的數學統計方法，其中最常用的是Box-Behnken的中心組合設計原理，本研究采用Box-Behnken中心組合設計對Plackett-Burman實驗篩選到的關鍵因子進一步研究，以獲得影響黃孢原毛平革菌發酵產多糖的優化培養基。自變量按下式進行編碼變換：

式中，Xi為自變量xi的編碼值，x0為自變量xi在中心點的值，△xi為自變量變化步長。用標準多項式回歸方程，對實驗數據進行擬合，便得到一個二次多項式，該方程為描述相應量（應變量）自變量關系的經驗模型。模型可描述為：

式中，Y為預測響應值，β0為截距，βi為線性系數，βii為平方系數，βij為交互作用系數。用 Design Expert程序對實驗數據進行回歸擬合，并對擬合方程作顯著性檢驗及方差分析。所得擬合方程式（2）分別對各自變量求偏導數，得到方程

2 結果與討論

2.1 Plackett-Burman設計對顯著因子的篩選

根據單因素實驗，選用實驗次數N=12的實驗設計，對葡萄糖（A），酒石酸銨（B），培養轉速（D），培養時間（E），初始pH（G），培養溫度（H），接種量（J），菌體形態（K）8個因素進行考察，每個因素選高低2個水平，以多糖的產量作為響應值（Y）。另設3個虛擬列（C，F，I），以考察實驗誤差。對實驗結果進行分析得出各因素的t值和可信度水平。實驗設計及結果如表1所示（每組實驗有3個重復，以平均值為準），分別計算各因素效應并進行重要性評價，結果見表2。

由表2的分析結果可知，在黃孢原毛平革菌產多糖過程中，培養溫度、酒石酸銨和初始pH三個因素對多糖產量影響顯著，可信度在90%以上，可考慮作為主要因素進一步做響應面實驗。而其他因素的取值則根據各因素效應的正負和大小，正效應的因素均取較高值，負效應的因素均取較低值。

2.2 響應面分析實驗優化設計培養基

2.2.1 Box-Behnken實驗設計 根據 Plackett-Burman實驗確定的實驗因素和水平，采用 Box-Behnken實驗設計對產多糖發酵培養基進行三因素三水平的響應面分析實驗，以培養溫度X1（℃），酒石酸銨濃度X2（g/L）和初始pH X3為自變量，響應值Y為多糖產量。實驗設計及結果見表3。

表3 三因素三水平的Box-Behnken實驗設計及相應結果

2.2.2 二次回歸擬合及方差分析 利用統計軟件MINITAB14.11對實驗數據進行二次多項回歸擬合。多項式模型方程擬合的性質由確定系數R2表達，其統計學上的顯著性由T檢驗確定。通過RSREG（響應面回歸）過程進行數據分析，建立二次響應面回歸模型，并進而尋求最優相應因子水平，所得的分析結果見表4。

表4 Box-Behnken實驗設計回歸分析結果

圖1～圖3為響應面分析的立體圖，從圖中可直觀地看出各因子對響應值的影響變化趨勢，而且回歸模型確實存在最大值。求解方程組可以得出模型的極值點：X1=0.713，X2=-0.226，X3=0.174。相當于培養溫度38.565℃，酒石酸銨0.4322g/L，初始pH 4.4631。

圖1 Y=f（X1，X2）響應面

圖2 Y=f（X1，X3）響應面

圖3 Y=f（X2，X3）響應面

為了檢驗模型預測的準確性，在最佳發酵條件和原始發酵條件分別進行發酵實驗，所得實際產多糖量分別為467.9mg/L和289.3mg/L，可見該模型能較好地預測實際發酵情況。

3 結論

實驗證明，Plackett-Burman設計與響應面方法（RSM）相結合的實驗統計方法能快速、有效地從眾多影響黃孢原毛平革菌多糖產量液體發酵的因素中篩選出比較重要的影響因素并實現條件優化，得到最佳操作條件，優化結果與實際發酵情況吻合較好。

經上述方法優化，黃孢原毛平革菌產多糖液體發酵的最佳培養基為：葡萄糖10g/L，酒石酸銨0.4g/L，大量溶液60mL/L；微量元素液25mL/L；維生素B11mg/L；最佳發酵條件為pH4.5，發酵溫度37℃，接種量10%，非固定化培養5d。在此條件下，多糖產量從289.3mg/L提高到467.9mg/L。

［1］郭敏，張寶善，金曉輝.微生物發酵生產多糖的研究進展［J］.微生物學通報，2008，35（7）：1084-1090.

［2］劉慧，張紅星，代娟.藏靈菇中嗜熱鏈球菌高產胞外多糖發酵條件的優化研究［J］.中國釀造，2007（6）：41-45.

［3］TienM，KirkTK.Lignin PeroxidaseofPhanerchaete chrysoprium［J］.Methods in Enzymolagy，1988，161：238-249.

［4］張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實驗方法和技術［M］.北京：高等教育出版社，1981.

［5］張維杰.復合多糖生化研究技術［M］.上海：上海科學技術出版社，1987：296.

［6］PlackettR L，BurmanJP.Thedesignofoptimum multifactorial experiments［J］.Biometrika，1946，33：305-325.

［7］Rama Mohan Reddy，Reddy P，Seenayya G.Production of thermostble b- amylase and pullulanase by Clostridium thermosulfurogenes SV2 in solid-state fermentation：Screening of nutrients using Plackett/Burman design［J］.Bioprocess and Biosystems Engineering，1999，21：175-179.

［8］Stowe R A，Mayer R P.Efficient Screening of Process Variables［J］.Industrial and Engineering Chemistry，1996，58（2）：36-40.

［9］Xin Chen，Yin Li，Guocheng Du，et al.Application of response surface methodology in medium optimization for spore production of Coniothyrium minitans in solid-state fermentation［J］.World Journal of Microbiologyamp;Biotechnology，2005，21：593-599.

［10］Adinarayana K，Ellaiah P.Response surface optimization of the critical medium components for this production of alkaline protease by a newly isolated Bacillus sp.［J］.Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Science，2002（5）：272-227.

［11］Chakravarti R，Sahai V.Optimization of compactinproduction in chemically defined production medium by Penicilliumcitrinum using statistical methods［J］.Process Biochemistry，2002，38：481-486.

Optimization of fermentation conditions for polysaccharides of Phanerchaete chrysoprium based on response surface analysis

XU Yan-yan，ZHANG Zhao-hui*
（Department of Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

Two level factorials designs of Plackett-Burman were constructed to select the Phanerchaete chrysoprium fermentation medium components of polysaccharides.Experimental results showed that culture temperature，ammonium tartrate concentration and initial pH all had significant influence on the polysaccharides production，and the optimal conditions were as follows：glucose 10g/L，ammonium tartrate 0.4g/L，the volume of mass element solution 60mL/L，the quantity of trace element solution 25mL/L，VB11mg/L，initial pH4.5，culture temperature 37℃，inoculation quantity of 10%，nonimmobilized culture 5d.Under the optimal conditions，the polysaccharides production was increased from 289.3mg/L to 467.9mg/L.

Phanerchaete chrysoprium；polysaccharides；response surface method；optimization

TS201.2+3

A

1002-0306（2010）11-0221-04

2009-10-14 *通訊聯系人

許艷艷（1982-），女，碩士研究生，研究方向：生物工程。