響應面法優化大豆肽與鈣離子螯合的研究

孫莉潔 梁金鐘,2

(東北林業大學林學院1,哈爾濱 150040)

(哈爾濱商業大學食品工程學院2,哈爾濱 150076)

響應面法優化大豆肽與鈣離子螯合的研究

孫莉潔1梁金鐘1,2

(東北林業大學林學院1,哈爾濱 150040)

(哈爾濱商業大學食品工程學院2,哈爾濱 150076)

為優化大豆肽 -鈣的螯合工藝,在單因素的基礎上,應用響應面法對大豆肽與氯化鈣的混合質量比、水浴時間以及無水乙醇添加倍數之間的交互作用進行試驗探討并確立了最佳水平。研究結果表明:無水乙醇添加倍數顯著地影響了大豆肽 -鈣螯合效果,混合質量比、水浴時間次之,優化的最佳條件為:混合質量比4.2∶1,水浴時間 21.3 min,無水乙醇添加 6倍,在此條件下,大豆肽 -鈣的得率為 65.4752%,鈣質量比為7.74 g/(100 g大豆肽 -鈣產品)。大豆肽與大豆肽 -鈣的傅里葉變換紅外光譜對照結果顯示:在大豆肽 -鈣的螯合工藝中,氨基與羧基均參與了螯合反應。

大豆肽 螯合鈣 工藝 響應面法

國內外的調查結果表明,鈣缺乏相關性疾病是長期缺鈣的結果[1]。無論是老人還是兒童,缺鈣幾乎是全球性的營養問題[2]。尤其對孕期婦女而言,鈣、鎂等微量營養素的補充對胎兒的生長發育非常必要[3]。因此,在提高膳食中對鈣的吸收利用率之外,尋求更高效的補鈣制劑亦是解決缺鈣問題的有效途徑。

國外已有學者對鈣調蛋白[4-5]和具有一定序列的肽之間的作用機理進行了系統研究,為我們提供了寶貴的經驗。大豆肽可與鈣、鋅、銅、鎂、鐵等金屬離子和微量元素形成絡合物,保護一些金屬離子和人體所必需的微量元素不被植酸、草酸、單寧所沉淀,并使微量元素處于良好的可溶狀態,有利于被機體吸收,顯著促進鈣、磷等礦物質和其他微量元素的吸收[6-7]。同時,大豆肽營養價值高,易于被人體吸收。因此,大豆肽 -鈣螯合物在理論上擁有雙重的營養價值:在補充優質氮源的同時,更促進了人體對鈣質的吸收。本試驗采用微生物發酵法生產制得的大豆肽作為原料與氯化鈣進行螯合,方法簡便可取,對鈣的螯合效果較好,并且改變了大豆肽的不良氣味。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

大豆肽粉:哈爾濱樂能生物工程有限股份公司。

無水乙醇:分析純,天津市東麗區天大化學試劑廠;高錳酸鉀、濃硫酸:分析純,天津市耀華化學試劑有限責任公司;甲基紅:分析純,天津市光復精細化工研究所;草酸銨、無水氯化鈣:分析純,天津市博迪化工有限公司;氨水:分析純,哈爾濱理工化學試劑有限公司;鹽酸:分析純,哈爾濱市新達化工廠。

1.2 試驗儀器及設備

ALC-210.2型電子天平:北京賽多利斯儀器系統有限公司;JA2003型電子天平:上海良平儀器儀表有限公司;DHG-9240型電熱恒溫鼓風干燥箱:上海一恒科學儀器有限公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋:上海博迅實業有限公司醫療設備廠;PHS-3C型精密pH計:上海雷磁儀器廠;Magna-IR 560 E.S.P型傅里葉變換紅外光譜儀:美國尼高力 (Nicolet)公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大豆肽 -鈣螯合工藝流程

大豆肽粉→一定量蒸餾水溶解→加入不同量的氯化鈣→調節 pH→混勻→水浴并攪拌→無水乙醇沉淀→離心→沉淀洗滌→鼓風干燥→大豆肽 -鈣

1.3.2 鈣的測定

采用高錳酸鉀滴定法[8]進行測定。

1.3.3 鈣質量比計算公式

KMnO4KMnO4為滴定消耗的高錳酸鉀的體積/L;MCa=40 g/mol;ms為大豆肽 -鈣的質量/g

1.3.4 大豆肽 -鈣得率計算公式

式中:ms為大豆肽 -鈣質量 /g;C大豆肽=50 g/L;V大豆肽為每次試驗添加大豆肽液的體積 /L;C氯化鈣=100 g/L;V氯化鈣為每次試驗添加氯化鈣的體積 /L。

1.3.5 單因素試驗

將 50 g/L的多肽溶液與 100 g/L氯化鈣按一定質量比進行混合,調節 pH,充分攪拌使其混勻,在一定溫度條件下水浴保持一定時間,隨后加入合適體積的無水乙醇,離心、鼓風干燥得到大豆肽 -鈣,稱重。稱取0.2～0.3 g大豆肽 -鈣按照高錳酸鉀滴定法測定其中的鈣質量比,通過大豆肽 -鈣得率和鈣含量兩個指標來衡量和確定最佳的螯合工藝,并通過響應面法進一步優化試驗設計。

1.3.6 大豆肽 -鈣螯合物結構的初步分析

采用傅里葉變換紅外光譜法進行螯合物結構的初步分析:取少量試樣,加入 KBr做稀釋劑,在瑪瑙研缽里研磨至粒子細小而均勻,壓片成型。用傅立葉變換紅外光譜儀測試,分辨率設置為 4 cm-1,掃描次數 40次。

2 試驗結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 大豆肽與氯化鈣的混合質量比例對大豆肽-鈣得率的影響

將 50 g/L的多肽溶液與 100 g/L氯化鈣按質量比1∶1、2∶1、1∶3、1∶4、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1進行混合 ,調節至 pH 7.0,充分攪拌使其混勻,在 50℃下水浴保持 30 min,隨后加入 8倍于混合液體積的無水乙醇,離心、鼓風干燥得到大豆肽 -鈣,稱重。稱取0.2～0.3 g大豆肽 -鈣按照高錳酸鉀滴定法測定其中的鈣質量比,通過大豆肽 -鈣的得率和鈣質量比兩個指標來確定最佳的混合比例。

圖 1 大豆肽與氯化鈣的混合質量比對大豆肽 -鈣得率的影響

如圖 1所示,大豆肽 -鈣得率、鈣質量比兩組曲線的變化趨勢基本一致。當大豆肽與氯化鈣質量比達到4∶1時,大豆肽 -鈣得率達到最大值,此時,每100 g大豆肽 -鈣產品中的鈣質量比也達到最大。可以認為,此時大豆肽與氯化鈣可以比較充分地螯合,因此選擇混合比4∶1作為最佳的混合比值。

2.1.2 pH對大豆肽 -鈣得率的影響

將 50 g/L的多肽溶液與 100 g/L氯化鈣按質量比4 ∶1進行混合 ,調節 pH分別為 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0,充分攪拌使其混勻 ,在 50 ℃下水浴保持 30 min,隨后加入 8倍于混合液體積的無水乙醇,離心、鼓風干燥得到大豆肽 -鈣,稱重。稱取 0.2～0.3 g大豆肽 -鈣按照高錳酸鉀滴定法測定其中的鈣質量比,通過大豆肽 -鈣的得率和鈣質量比兩個指標來確定最佳的 pH。

圖 2 pH對大豆肽 -鈣得率的影響

如圖 2所示,在 pH從 1到 7的改變中,兩組曲線的變化均比較大,但基本趨勢依然一致。在酸性條件下,大豆肽會發生部分解離,使得和鈣反應的-COO-增加,pH 5.5時達到較大值。隨著 pH的增大,解離慢慢變弱,部分大豆肽通過吸附作用與鈣結合[9],從而使得大豆肽 -鈣得率在 pH 6.5時達到最大值。而在偏堿性或者堿性條件下,會產生Ca(OH)2,從而會影響大豆肽與鈣的螯合,因此,本試驗不研究堿性條件下的螯合。此單因素試驗結果表明,pH 6.5可以作為后續研究的最佳參數。

2.1.3 水浴溫度對大豆肽 -鈣得率的影響

將 50 g/L的多肽溶液與 100 g/L氯化鈣按質量比4∶1進行混合,調節至 pH 6.5,充分攪拌使其混勻,分別在 30、40、50、60、70 ℃下水浴保持 30 min,隨后加入 8倍于混合液體積的無水乙醇,離心、鼓風干燥得到大豆肽 -鈣,稱重。稱取 0.2～0.3 g大豆肽 -鈣按照高錳酸鉀滴定法測定其中的鈣質量比,通過大豆肽 -鈣的得率和鈣質量比兩個指標來確定最佳的水浴溫度。

圖 3 水浴溫度對大豆肽 -鈣得率的影響

從圖 3可知,兩組曲線的變化趨勢一致,而且隨著溫度的升高,均沒有大幅的變化。即說明大豆肽-鈣螯合反應中,溫度對大豆肽 -鈣得率影響不大。在后續試驗中,選擇 50℃作為最佳的反應溫度。

2.1.4 水浴時間對大豆肽 -鈣得率的影響

將 50 g/L的多肽溶液與 100 g/L氯化鈣按質量比4∶1進行混合,調節至 pH 6.5,充分攪拌使其混勻,在 50 ℃下分別水浴保持 0、10、20、30、40、50 min,隨后加入 8倍于混合液體積的無水乙醇,離心、鼓風干燥得到大豆肽 -鈣,稱重。稱取 0.2～0.3 g大豆肽-鈣按照高錳酸鉀滴定法測定其中的鈣質量比,通過大豆肽 -鈣的得率和鈣質量比兩個指標來確定最佳的水浴時間。

圖 4 水浴時間對大豆肽 -鈣得率的影響

水浴時間對大豆肽 -鈣得率的影響如圖 4所示。由圖 4可知,在水浴時間 20 min時,大豆肽 -鈣得率和鈣質量比均達到最大值。這是因為通過吸附作用而產生的大豆肽 -鈣隨著反應的進行發生著動態的吸附和解析過程,20 min時達到動態平衡。因此在后續試驗中,選擇反應時間 20 min作為最佳的參數。

2.1.5 無水乙醇添加量對大豆肽 -鈣得率的影響

將 50 g/L的多肽溶液與 100 g/L氯化鈣按質量比4∶1進行混合,調節至 pH 6.5,充分攪拌使其混勻,在 50℃下水浴保持 20 min,隨后分別加入 4、6、8、10、12倍于混合液體積的無水乙醇,離心、鼓風干燥得到大豆肽 -鈣,稱重。稱取 0.2～0.3 g大豆肽 -鈣按照高錳酸鉀滴定法測定其中的鈣質量比,通過大豆肽 -鈣的得率和鈣質量比兩個指標來確定最佳的無水乙醇添加量。

圖 5 無水乙醇添加倍數對大豆肽 -鈣得率的影響

無水乙醇的添加量對大豆肽 -鈣得率的影響如圖 5所示。不同的乙醇添加倍數對大豆肽 -得率以及鈣質量比的影響都比較大。當無水乙醇體積是混合液體積的 6倍時,兩者都達到最大值。這是因為,乙醇添加量過少,沉淀不夠充分,添加量過多,又會破壞大豆肽與鈣的結合,乙醇和氯化鈣反應生成CaCl2·4C2H5OH,因此,適當的添加量對大豆肽 -鈣的影響也很大,在后續試驗中,選擇 6倍于混合液體積的無水乙醇添加量作為最佳參數。

2.2 響應面法優化試驗設計結果與分析

根據 Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理[10],綜合單因素的試驗結果,選取大豆肽與氯化鈣的混合質量比、水浴時間、無水乙醇添加倍數進行三因素三水平的響應面分析試驗,表 1為響應面因素水平設計。表 2為響應面回歸試驗設計與試驗結果。

表 1 響應面因素水平設計

表 2 響應面設計與試驗結果

試驗編號 1～12是析因試驗,試驗編號 13～15是中心試驗。15個試驗點分為析因點和零點,其中析因點為自變量取值在 x1、x2、x3所構成的三維頂點上;零點為區域的中心點,零點重復 3次,以估計試驗誤差。應用統計軟件 SAS-RSREG程序對表 2中所得數據進行多元回歸擬合分析,二次多元回歸方程為:

Y=0.648 466 67+0.041 850 00x1+0.000 667 50x2+0.002 150 00x3-0.067 983 333x1x1+0.003 550 00x2x1-0.013 933 3x2x2+0.008 550 00x3x1-0.000 350 00x3x2-0.026 483 33x3x3

對該方程的方差分析結果見表 3,回歸系數顯著性檢驗結果見表 4,方程的驗證結果見表 5,響應面圖和等高線圖分別見圖 6～圖 8。

表 3 回歸方程方差分析

從表 3可以看出,用上述回歸方程描述各因素與響應值之間的關系時,各因素中一次項和二次項比較顯著,但交叉項不顯著。因此,各具體試驗因子對響應值的影響不是簡單的線性關系。響應面的模型總離差平方和為 0.001 397。3個因子對 Y的效應有一次項、二次項和交叉項。由 R=0.980 5、R2=0.961 3可以得出此模型的符合度為 96.13%,模型擬合大豆肽 -鈣螯合得率與 3個因子的關系確立。

表 4 回歸系數顯著性檢驗和結果

從表 4可以看出,回歸方程對試驗擬合較好,方差分析結果較顯著,因此可用回歸方程代替試驗值進行分析。

表 5 方程檢驗結果方差分析

由表 5中檢驗結果的方差分析表明,P值為0.952 8,檢驗結果與模型計算結果沒有顯著差異。

圖 6 Y=f(x1,x2)的響應面及等高線

圖 6～圖 8反映了各因素對響應值的影響。從等高線圖可以看出,極值條件應在圓心處。比較 3組圖可知,無水乙醇添加倍數 (x3)是影響大豆肽 -鈣得率的最顯著因素,混合比 (x1)和水浴時間 (x2)次之,說明 x1、x2對響應值影響相對較小。

由圖 6～圖 8可以看出,大豆肽 -鈣得率隨無水乙醇添加倍數的增大而增大,而混合質量比和水浴時間在設定的范圍內都有一個最大值。由于無水乙醇添加量增加,無水乙醇會奪取被大豆肽結合的鈣離子重新與氯離子和乙醇形成 CaCl2·4C2H5OH的幾率增大,從而減少大豆肽 -鈣的得率,所以選擇 6倍于混合液體積的無水乙醇添加量是最適合的量;最佳混合質量比和水浴時間可以由上述方程求導得到:混合質量比為4.184∶1,水浴時間為21.287 min。由響應面模型可得出無水乙醇添加 6倍,水浴時間21.28 min、混合質量比4.184∶1是最佳的螯合條件。在該條件下由響應面模型預測的大豆肽 -鈣的得率為65.6208%。

為了驗證試驗的可靠性,采用最優條件進行大豆肽 -鈣的螯合。考慮到試驗操作的可行性,將最優螯合條件修正為無水乙醇添加 6倍,水浴時間21.3 min、混合質量比4.2∶1。在此條件下測得的大豆肽 -鈣得率為 65.4752%,(鈣質量比 7.74 g/100 g大豆肽 -鈣)與理論預測值的誤差為 2.23%,說明采用 RS M法優化得到的浸提螯合條件可靠。

2.3 大豆肽與大豆肽 -鈣紅外色譜結果

取少量試樣,加入 KBr做稀釋劑,在瑪瑙研缽里研磨至粒子細小而均勻,壓片成型。用傅立葉變換紅外光譜儀測試,分辨率設置為 4 cm-1,掃描次數 40次。圖 9為大豆肽紅外色譜圖,圖 10為大豆肽 -鈣紅外色譜圖。

圖 9和圖 10分別是大豆肽與鈣結合前后的紅外光譜圖,圖 9中 3 274 cm-1是由 N-H伸縮振動引起,而在圖 10中,此波段變為 3 376 cm-1,向高波段移動了 102個波數,成為銨鹽 NH4+的特征頻率,因此可判斷,大豆肽中氨基參與了鈣的螯合;同時圖 9中 1 455 cm-1出的吸收峰在圖 10中幾乎被掩蓋,圖9中的 1 400 cm-1在圖 10中是 1 408 cm-1,向高波位移動了 8個波數,成為 COO-伸縮振動引起的羧酸鹽的特征頻率[11],因此,可以判斷,羧基參與了大豆肽-鈣的螯合反應。

3 結論

3.1 大豆肽 -鈣螯合工藝通過響應面法優化后,最佳的工藝參數為:大豆肽與氯化鈣的混合質量比4.2∶1,水浴時間 21.3 min,無水乙醇添加 6倍,在此條件下大豆肽 -鈣的得率可達 65.4752%,鈣質量比為 7.74 g/(100 g大豆肽 -鈣產品)。

3.2 通過紅外色譜圖可以判斷,在大豆肽 -鈣的螯合試驗中,氨基與羧基均參與了螯合反應,關于鈣是否與大豆肽通過吸附作用結合的論斷在紅外圖譜中沒有體現,有待進一步考證。

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Opti mization of Chelation of Soybean Peptides with Calcium Using Response SurfaceMethod

Sun Lijie1Liang Jinzhong1,2
(College of Forest,Northeast ForestryUniversity1,Harbin 150040)
(College of Food Engineering,Harbin University of Commerce2,Harbin 150076)

To opti mum the chelation technology of soybean peptideswith calcium,based on single factor tests,the response surface method was used to investigate the interaction of soybean peptides to CaCl2ratio,water bath time and the times of absolute alcohol volume to mixed liquor volume;finally their optimum levelswere established.Re2 sults:The times of absolute alcohol volume to mixed liquor is much more i mportant than the other two factors.The optimum process parameters for the soybean peptides-calcium chelation are soybean peptides to CaCl2ratio 4.2∶1,water bath time 21.3 min,and the times of absolute alcohol volume to mixed liquor volume 6.Under the conditions the yield of soybean peptides-calcium is 65.4752%,and the calcium content of product is up to 7.74 g per 100 g soybean peptides-calcium.The comparison of Fourier transform infrared spectroscopy between soybean peptides and soybean peptides-calcium shows that both amino groups and carboxyl groups participate in the chelating reaction.

soybean peptides,sequestration calcium,technology,response surface method

TS201.2

A

1003-0174(2010)01-0022-06

2009-01-20

孫莉潔,女,1983年出生,碩士,食品科學

梁金鐘,男,1957年出生,教授,發酵工程