豬流行性腹瀉診斷方法的研究進(jìn)展

喻明成，甘振磊，湯德元，李春燕，王 彬，張曉杰，王 鳳，劉志杰

（1.貴州省貴陽市草地生態(tài)畜牧發(fā)展中心，貴州 貴陽 550330；2.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由套式病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬的豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，以水樣腹瀉、嘔吐、脫水和食欲下降為主要特征的傳染病。本病有一定的季節(jié)性，多發(fā)生于冬季12 月至第2 年2 月寒冬季節(jié)，但在夏季也可發(fā)生。PED 在各年齡的豬均可感染，傳播迅速，仔豬死亡率高，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。臨床上由于PED 與豬傳染性胃腸炎（TGE）的臨床癥狀極其相似，再加上PED 經(jīng)常與其他腹瀉類疾病混合感染，所以僅憑臨床癥狀來確診PED 較為困難，還需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。本文主要針對豬的流行性腹瀉的流行病學(xué)診斷、臨床及病理診斷、病原學(xué)診斷、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷等進(jìn)行闡述，為該病的確診提供參考。

1 流行病學(xué)診斷

豬流行性腹瀉發(fā)病有一定的季節(jié)性，多發(fā)生于冬季12 月至第2 年2 月寒冬季節(jié)，但在夏季也可發(fā)生。該病自1971 年首次在英國暴發(fā)以來，相繼在比利時(shí)、德國、匈牙利、瑞士等許多歐洲國家也都暴發(fā)了PED。在1978 年英國和比利時(shí)首次報(bào)道分離得到該病的病毒，確診了PEDV 的感染。隨后，20世紀(jì)80 年代，日本、韓國、中國等一些亞洲國家暴發(fā)了豬腹瀉病，經(jīng)熒光抗體試驗(yàn)和血清中和試驗(yàn)診斷為PEDV 感染而導(dǎo)致的豬腹瀉。我國于1980 年首次成功分離到PEDV，以后許多地區(qū)均有本病發(fā)生的報(bào)道。各種年齡的豬都能感染發(fā)病，哺乳仔豬、斷奶仔豬和育肥豬感染發(fā)病率達(dá)100%，成年母豬為15%～90%，其中，1 周齡哺乳仔豬受害最嚴(yán)重，病死率平均50%，但有時(shí)高達(dá)90%，但4～5 周齡的哺乳仔豬病死率不高，尤其是無母源抗體的哺乳仔豬不發(fā)生或僅發(fā)生輕微腹瀉，發(fā)病率和死亡率都很低。另外，癥狀的輕重程度會隨年齡的大小而有差異，年齡越小的，其癥狀表現(xiàn)的越重[1]。1 周齡的哺乳仔豬腹瀉在2～4 d 內(nèi)因脫水而死亡，日齡較大的仔豬約1 周后可康復(fù)。斷奶豬、肥育豬以及母豬常呈現(xiàn)沉郁和厭食癥狀，持續(xù)腹瀉4～7 d，逐漸恢復(fù)正常。成年豬可能只表現(xiàn)沉郁、厭食和嘔吐，一般經(jīng)4～5 d 即可好轉(zhuǎn)。

2 臨床及病理診斷

該病的臨床癥狀主要是發(fā)病豬群都呈黃色水樣腹瀉，體溫基本正常，少數(shù)病豬出現(xiàn)體溫升高l～2 ℃，并帶有惡臭氣味的稀便等特征。本病的潛伏期長短不一，哺乳仔豬8～36 h，育肥豬1～3 d 或可能潛伏時(shí)間更長。其臨床癥狀的嚴(yán)重程度變化較大，主要取決于豬群免疫力及地方流行性。一般豬通常由拉水樣糞便、嚴(yán)重脫水和代謝性酸中毒而引起死亡。哺乳仔豬和育肥豬還表現(xiàn)為嘔吐、精神沉郁、發(fā)病率較高但死亡率低等特點(diǎn)，尤其在育肥后期，大多豬群在7～10 d 后康復(fù)，死亡率只有1%～3%，而這種死亡經(jīng)常在腹瀉的早期，剖檢病死豬常見背部肌肉壞死。應(yīng)激敏感性高的豬群發(fā)生PED 時(shí)死亡率更高。該病的臨診癥狀與豬傳染性胃腸炎（TGE）十分相似，但程度較TGE 輕，在同窩豬群中傳播的速度也比TGE 慢得多。解剖豬的腹腔可以觀察到小腸內(nèi)充滿了液體，腸道內(nèi)呈現(xiàn)大量黏樣或水樣糞便，腸體膨脹，小腸壁變薄，腸系膜充血、水腫，淋巴結(jié)水腫，心臟擴(kuò)張，內(nèi)臟器官淤血。病豬的組織學(xué)變化主要為空腸中后部的小腸絨毛上皮細(xì)胞脫落、絨毛變短，但在結(jié)腸，未能觀察到組織病理學(xué)變化。

圖1 小腸絨毛顯著縮短，變得鈍圓。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

豬流行性腹瀉的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要包括病原學(xué)診斷、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷法。近幾年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，原位雜交技術(shù)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)診斷技術(shù)因其快速、方便、特異性強(qiáng)、敏感和準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)已成為實(shí)驗(yàn)室最常用的檢測方法。同時(shí)，病原學(xué)診斷和血清學(xué)診斷方法也有了很大的發(fā)展，經(jīng)過不斷的改進(jìn)和完善，其診斷方法具備了簡單、快速、可重復(fù)性強(qiáng)等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室診斷。現(xiàn)就以上診斷方法分別敘述如下：

3.1 病原學(xué)診斷

3.1.1 病毒的分離與鑒定

通過采集仔豬空腸及腸內(nèi)容物或刮取空腸及腸內(nèi)容物在青霉素和鏈霉素PBS 液中制成5 倍懸液，然后通過離心取上清液經(jīng)220 nm 微孔濾膜過濾，將濾液接種于Vero 細(xì)胞單層上，放在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，觀察細(xì)胞有無病變。有病變的細(xì)胞可見細(xì)胞面粗糙，顆粒增多，有多核細(xì)胞，細(xì)胞逐漸脫落；或?qū)V液感染試驗(yàn)仔豬，觀察仔豬的病理變化和臨床癥狀，進(jìn)行回歸動物試驗(yàn)。如武三孝[2]將試驗(yàn)仔豬分為A、B、C、D 4 組，A 組是口服加雙抗的腸液（剪右耳做標(biāo)記）；B 組口服未加雙抗腸液（剪左耳做標(biāo)記）；C 組口服腸管磨碎物（剪雙耳做標(biāo)記）；D 組作空白對照組。口服劑量每組均為50 mL 和30 mL 各1 頭，48 h 后觀察臨床癥狀。回歸動物試驗(yàn)可驗(yàn)證所分離的病毒。

3.1.2 免疫電鏡法

一般來說，電鏡法可以有效的作出病原的診斷，可以通過電鏡來觀察病毒的結(jié)構(gòu)、形態(tài)特征及立體構(gòu)型等特點(diǎn)。如將感染豬小腸或病毒細(xì)胞培養(yǎng)物制成超薄切片在電鏡下觀察，則可從平面上觀察到病毒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，形態(tài)大小，復(fù)制方式等。由于TGEV 與PEDV 同屬冠狀病毒，形狀非常相似，在普通電鏡下無法區(qū)別，為此需要用免疫電鏡法（IEM）。IEM 法既可用已知的PEDV 高免血清檢測未知抗原，又可用已知的PEDV 抗原檢測未知抗體。王繼科等[3]把抗原和抗體分別經(jīng)10 000 g/min 離心，免疫復(fù)合物又經(jīng)12 000 g/min 離心，最后在電鏡下直接觀察到典型的病毒粒子形成的免疫復(fù)合物，建立了具有3 次篩選作用的改良的IEM 法，具有簡便、直觀、快速和定性正確等優(yōu)點(diǎn)。但由于需用電鏡設(shè)備，其價(jià)格十分的昂貴，一般的實(shí)驗(yàn)室及豬場沒有這樣的條件，不適合于大規(guī)模診斷和臨床診斷。

3.2 血清學(xué)診斷

3.2.1 免疫熒光法

免疫熒光法（IF）一般分為直接免疫熒光法（FAT）、間接免疫熒光法（IFAT）和免疫過氧化物酶技術(shù)，3 種方法都可應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室診斷，但前者較為常用。若IF 或免疫過氧化物酶試驗(yàn)呈陽性，并伴有腹瀉癥狀，則幾乎肯定為PEDV、。較常用的是直接免疫熒光法（FAT）檢測，是一種比較可靠的特異性診斷方法。在1990 年，崔現(xiàn)蘭等應(yīng)用FAT 檢查病豬小腸的冷凍切片或小腸抹片，對PEDV 人工感染仔豬檢出率為91.4%，電鏡觀察陽性率為47.8%。應(yīng)用間接免疫熒光法(IFAT)對PED 陽性豬血清的檢出陽性率為89%[4]。后來，在1997 年，林志雄等用適用于Vero、PK-15 等傳代細(xì)胞株生長繁殖的PEDV-G1 株直接免疫免疫熒光法，用該方法檢測來自有嚴(yán)重腹瀉、嘔吐和死亡癥狀的6 個(gè)豬場155 份仔豬腸黏膜樣品，檢出率為52%，并用血清中和試驗(yàn)檢測該6 個(gè)豬場的PEDV抗體，證實(shí)被PEDV 感染過。同時(shí)，應(yīng)用哈爾濱獸研所的熒光抗體方法比較，陽性符合率達(dá)95%，陰性符合率90%。并不與豬傳染性胃腸炎病毒、豬細(xì)小病毒、輪狀病毒和大腸桿菌等發(fā)生交叉反應(yīng)。證明該方法具有較高的準(zhǔn)確性和特異性、。而朱維正等用間接血凝試驗(yàn)與間接免疫熒光法（IFAT）比較后認(rèn)為IFAT 法更敏感。

3.2.2 微量血清中和試驗(yàn)

病毒活毒素與相應(yīng)的抗體結(jié)合后，失去對易感動物群的致病力，稱之為中和試驗(yàn)。中和試驗(yàn)還可以分為兔體中和試驗(yàn)、熒光抗體病毒中和試驗(yàn)、過氧化物酶聯(lián)中和試驗(yàn)等。中和試驗(yàn)主要用于：1）從待檢血清中檢出抗體，或從病料中檢出病毒，用于診斷病毒性傳染病；2）用抗毒素血清檢查材料中的毒素或鑒定細(xì)菌的毒素類型；3）測定抗病毒血清或抗毒素效價(jià)；4）新分離病毒的鑒定和分型，中和試驗(yàn)不僅可在易感的實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)進(jìn)行，亦可在細(xì)胞或雞胚上進(jìn)行。在1994 年，我國的研究工作者林志雄等[5]建立了PEDV 微量中和試驗(yàn)。采用適應(yīng)于傳代細(xì)胞生長的PEDV-GI株，以PK-l5(豬腎細(xì)胞)作為指示細(xì)胞，48 h 判定。研究證實(shí)本方法檢驗(yàn)準(zhǔn)確、可靠、具有較高的敏感性、可用于流行病學(xué)調(diào)查。

3.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA法）

目前，ELISA 法最大的優(yōu)點(diǎn)就是可從糞便中直接檢查PEDV 抗原，應(yīng)用較為廣泛。但在ELISA 方法出現(xiàn)之前，國外許多學(xué)者都是利用培養(yǎng)病毒的方法直接對PEDV 抗體進(jìn)行檢測。如1988年Hofmann 等[6]首次報(bào)道將PEDV 適應(yīng)于Vero 傳代細(xì)胞培養(yǎng)后，對PED 診斷學(xué)方面的研究迅速地有了較大進(jìn)展，應(yīng)用于PED 及其抗體檢測的診斷試劑制備和檢測方法的建立，但由于PEDV適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)難度大及制備全病毒抗原存在潛在排毒的危險(xiǎn)，致使現(xiàn)有的診斷方法僅限于實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用階段尚未能大量應(yīng)用于臨床實(shí)踐，因而急需一種安全、穩(wěn)定、快速、易于制備且特異性和重復(fù)性均高的新型診斷方法的建立以適用于大批次試樣的檢測。用ELISA 方法檢測PEDV 被大量應(yīng)用于臨床實(shí)踐中，該法既可用于測定抗原，也可用于測定抗體，是國際貿(mào)易指定標(biāo)準(zhǔn)診斷方法之一。根據(jù)ELISA 的基本原理，發(fā)展出了雙抗體夾心法ELISA、競爭阻斷ELISA、間接ELISA 以及斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（Dot-ELISA 法）等診斷方法。

3.2.3.1 雙抗體夾心法ELISA

該法屬于非競爭結(jié)合測定。它是檢測抗原最常用的ELISA，適用于檢測分子中具有至少兩個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測。朱維正（1988）應(yīng)用雙抗體ELISA 法從腹瀉病豬糞便中直接檢測病毒抗原，首先將特異性抗體包被固相載體上，其次加待檢標(biāo)本，然后加酶標(biāo)抗體，使形成固相抗體—待測抗原—酶標(biāo)抗體夾心復(fù)合物，最后加底物顯色，從而檢測標(biāo)本中抗原的量。其檢測結(jié)果與電鏡檢查的陽性符合率為97.37%，陰性符合率為100%。

3.2.3.2 競爭阻斷ELISA

該法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可對抗體進(jìn)行檢測。在國外，如Rodak L 等[7]利 用PEDV M 蛋 白的單克隆抗體建立了敏感性強(qiáng)、特異性高的競爭阻斷ELISA 診斷方法，適于PEDV 流行病學(xué)調(diào)查；Hou 等[8]利用PEDV 重組N 蛋白抗原建立了檢測PEDV 血清的ELISA 方法，為PEDV血清學(xué)監(jiān)測提供手段。Kim O 等[9]建立了單克隆抗體基礎(chǔ)上的免疫組化法，該方法可在福爾馬林固定、石蠟包埋的腸組織中準(zhǔn)確而特異的檢出PEDV，可用于鑒別診斷PEDV 與TGEV。

3.2.3.3 間接ELISA

此法是測定抗體最常用的方法，屬非競爭結(jié)合試驗(yàn)。在國外，Oh 等[10]建立了間接ELISA 診斷方法，與病毒血清中和試驗(yàn)對比證明，該ELISA 方法具有較高的敏感性和特異性，能用于PEDV 的檢測。國內(nèi)對PEDV 的診斷主要代表有于強(qiáng)等[11]在1987 年用PEDV吉毒株豬胎腸單層細(xì)胞培養(yǎng)物，以凍融法制備抗原，建立了間接ELISA 法檢測PED 抗體的方法。對30 份直接免疫熒光證實(shí)的PED 病豬群血清測定，97%為陽性，并證實(shí)包被板在－20 ℃可保存2 個(gè)月。

3.2.3.4 斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Dot-ELISA）

該方法是在常規(guī)ELISA 方法的使用中不斷進(jìn)行改進(jìn)和衍化而來的一種新方法。新測定方法的問世，不僅進(jìn)一步提高了測定靈敏度、特異性，而且使ELISA 技術(shù)提高了自動化程度，使其應(yīng)用更加簡便、快速。陳茹等[12]在1997年用分離純化的PEDV 抗原，建立斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Dot-ELISA）檢測豬流行性腹瀉（PED）抗體。采用此方法分別對來自加拿大、中國臺灣省進(jìn)口的種豬和海南省、廣東省種豬群的血清樣本共834 份進(jìn)行了檢測，檢測的抗體陽性率達(dá)21%。用瓊擴(kuò)試驗(yàn)與Dot-ELISA 比較，陰性血清樣品檢測符合率為100%，而陽性血清樣品檢測符合率為31.8%。說明后者更敏感，且該試驗(yàn)重復(fù)性較好。檢測試劑在4 ℃保存60 d 以及室溫保存30 d，其檢測效果基本一致。

3.3 分子生物學(xué)診斷

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域?yàn)樨i的流行性腹瀉的診斷提供了基因分析的多種方法，很多病毒性疾病都可以通過分子生物學(xué)進(jìn)行有效的診斷，分子生物學(xué)診斷技術(shù)具有簡單方便、準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)、敏感度高、檢測速度較快等優(yōu)點(diǎn)。目前，許多實(shí)驗(yàn)室診斷都普遍采用是原位雜交技術(shù)（ISH）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）2 種方法來檢測PEDV。ISH 是分子生物學(xué)、組織化學(xué)及細(xì)胞學(xué)相結(jié)合一種診斷技術(shù)；PCR 是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA 片段，還有限制性內(nèi)切酶譜對病毒特定基因階段及相對應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，可作出確定的被檢病毒在冠狀病毒屬中的位置。

3.3.1 原位雜交技術(shù)（ISH）

原 位 雜 交 技 術(shù)（in situ hybridization，ISH）是分子生物學(xué)、組織化學(xué)及細(xì)胞學(xué)相結(jié)合而產(chǎn)生的一門新興技術(shù)，始于20 世紀(jì)60 年代。在20 世紀(jì)60 末至70 年代初，美國一些專家Gall 和Buongiorno-Nardelli 等 利用同位素標(biāo)記的核酸基因探針進(jìn)行了與細(xì)胞或組織基因定位，從而創(chuàng)造了原位雜交技術(shù)。原位雜交技術(shù)的基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織、細(xì)胞或染色體上待測DNA 或RNA 互補(bǔ)配對，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測手段將待測核酸在組織、細(xì)胞或染色體上的位置顯示出來。為顯示特定的核酸序列必須具備3 個(gè)重要條件：組織、細(xì)胞或染色體的固定、具有能與特定片段互補(bǔ)的核苷酸序列（即探針）、有與探針結(jié)合的標(biāo)記物。Okjin Kim 等[13]利用標(biāo)記地高辛的核酸探針（0.1 ng/μL）加入的300μL 的標(biāo)準(zhǔn)雜交緩沖液中，在加熱板上95 ℃加熱10 min 后把組織切片放到冰上淬火。大約有50 ng 的地高辛的核酸探針添插到標(biāo)準(zhǔn)雜交緩沖液中（50 μL）。通過一系列的處理后，標(biāo)記地高辛的核酸探針可以與人工感染仔豬的PEDV 的核衣殼蛋白基因進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對，通過透射電鏡下觀察到仔豬的空腸和結(jié)腸的上皮細(xì)胞的胞質(zhì)呈黑色。從而可以證明是PEDV 感染的仔豬腹瀉。該試驗(yàn)在79 個(gè)陽性樣本中檢測出71 個(gè)是陽性的，檢出率為91%。另外，該試驗(yàn)還證明，原位雜交技術(shù)對于檢測福爾馬林溶液固定的組織樣本較為敏感，其檢測效果較好。

3.3.2 PCR 技術(shù)診斷

3.3.2.1 反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（RT-PCR）

在國外比較有代表性的研究工作者有Ishikawa 等[14]根據(jù)S 基因序列設(shè)計(jì)了一對可擴(kuò)增目的片段854 bp 的引物，成功的建立了診斷PEDV 的RT-PCR法，可進(jìn)行細(xì)胞毒和糞便毒的檢測，靈敏度可達(dá)100 TCID50/mL，并可在8 h內(nèi)測出。盡管此法敏感性和特異性都很好，但由于對儀器設(shè)備等要求很高，只能適合于實(shí)驗(yàn)室診斷，不能廣泛應(yīng)用于臨床診斷。Kim O 等對免疫組化、原位雜交、RT-PCR 3 種方法進(jìn)行了比較，認(rèn)為RT-PCR 法檢測結(jié)果的重復(fù)性最好。如Kubota 等[15]以M 基因和N 基因?yàn)榘谢蚪⒘薘T-PCR 方法來檢測PEDV，在糞便樣品中能檢測到PEDV 的最低含量為100 TCID50；Song 等建立了鑒別診斷PEDV、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬輪狀病毒（PORV）的多重反轉(zhuǎn)錄PCR（Multi-RT-PCR）為鑒別3 種病毒性腹瀉病原的混合感染提供了技術(shù)支持，同時(shí)又建立了檢測PEDV 的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，對仔豬體內(nèi)PEDV 的病毒載量進(jìn)行了定量；在韓國Kim O 等已建立了TGEV 和PEDV 的二聯(lián)RT-PCR診斷方法，可同時(shí)檢測出10TCID50/mL 的TGEV 和PEDV。但當(dāng)被檢樣品為福爾馬林固定時(shí)，采用免疫組化和原位雜交這2 種方法更適合。在國內(nèi)，楊群[16]等根據(jù)GenBank 上發(fā)表的豬流行性腹瀉（PEDV）和豬傳染性胃腸炎（TGEV）基因序列，針對其PEDV的M（膜蛋白）基因保守區(qū)及TGEV的S 基因（纖突蛋白基因）5′端保守區(qū)，各設(shè)計(jì)一對引物，建立了一種用來檢測PEDV 和TGEV 的多重RT-PCR的方法，同韓國引進(jìn)的PEDV 和TGEV病毒抗原快速診斷試劑盒檢測結(jié)果相比較，該法具有更好的特異性和敏感性。

3.3.2.2 熒光定量PCR

熒 光 定 量PCR（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR）技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR 進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。人們主要就是利用PCR 擴(kuò)增在某一特定擴(kuò)增時(shí)期，擴(kuò)增產(chǎn)物是指數(shù)增長的，那么最終PCR 產(chǎn)物與模板量直接相關(guān)的這種特點(diǎn)來進(jìn)行模板定量。PCR 定量關(guān)鍵是選擇好擴(kuò)增呈指數(shù)增長的最佳時(shí)機(jī)和內(nèi)部設(shè)置擴(kuò)增模板對照。由于PCR 定量方法是不斷放大的過程，使原有模板DNA 細(xì)小差異也隨之放大。因此PCR 定量技術(shù)與常規(guī)的Southern、Northern 和點(diǎn)印跡雜交定量相比非常敏感。同時(shí)要求反應(yīng)條件異常嚴(yán)格。該法克服了傳統(tǒng)PCR 易污染、后處理步驟繁雜冗長、缺乏準(zhǔn)確定量等缺點(diǎn)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，在PEDV 診斷方面也取得了進(jìn)展。Kim，S-H 等[17]根據(jù)Taq Man 探針熒光定量分析原理，F(xiàn)AM 作為熒光報(bào)告基團(tuán)，Cy5 作為淬滅基團(tuán)，建立了多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR，為PEDV 和TGEV 病毒載量的檢測提供了技術(shù)手段，其最低檢出量分別為9×101 拷貝/μL 和7×101 拷貝/μL。

3.3.2.3 原位PCR 法（in situ-PCR）原 位PCR 是Hasse 等 于1990 年建立的技術(shù)，原位PCR 技術(shù)是常規(guī)的原位雜交技術(shù)與PCR 技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，即通過PCR 技術(shù)對靶核酸序列在染色體上或組織細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行原位擴(kuò)增使其拷貝數(shù)增加，然后通過原位雜交技術(shù)進(jìn)行檢測，從而對靶核酸序列進(jìn)行定性、定位和定量分析。原位PCR 技術(shù)大大提高了原位雜交技術(shù)的靈敏度和專一性，可用于低拷貝甚至單拷貝的基因定位，是細(xì)胞學(xué)科研與臨床診斷領(lǐng)域里的一項(xiàng)有較大潛力的新技術(shù)。原位PCR 既能分辨鑒定帶有靶序列的細(xì)胞，又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置，對于在分子和細(xì)胞水平上研究疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)歸有重大的實(shí)用價(jià)值。自建立以來發(fā)展快速，將PCR 技術(shù)與原位雜交技術(shù)結(jié)合起來，既可以檢測低拷貝的DNA 或RNA，又可特異的確定細(xì)胞來源和細(xì)胞內(nèi)定位。

3.3.2.4 巢式PCR 法（nested-PCR）巢式PCR 是1 種變異的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用2 對PCR 引物擴(kuò)增完整的片段。第1 對PCR 引物擴(kuò)增片段和普通PCR 相似。第2 對引物稱為巢式引物（因?yàn)樗麄冊诘? 次PCR 擴(kuò)增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第1 次PCR 產(chǎn)物內(nèi)部，使得第2 次PCR 擴(kuò)增片斷短于第1 次擴(kuò)增。巢式PCR 的好處在于：如果第1 次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第2 次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對并擴(kuò)增的概率極低。因此，巢式PCR 的擴(kuò)增非常特異。該法由國外學(xué)者Kim L和Chang K O[18]所發(fā)明設(shè)計(jì)，此種方法是針對二者S 基因部分序列的差異性而設(shè)計(jì)出來的。反轉(zhuǎn)錄體系引物是針對于PRCV 的S 基因缺失區(qū)而設(shè)計(jì)，上游引物和下游引物恰好位于PRCV S 基因缺失區(qū)兩端。這樣對樣品進(jìn)行RTPCR反應(yīng)結(jié)果是：如果有PEDV的存在，那么產(chǎn)物應(yīng)為陽性，在電泳的泳道上可觀察到與預(yù)先設(shè)計(jì)一樣大小的DNA 片段：反之，則為陰性。此外，Kim O 等還建立了鑒別TGEV 和PEDV 的多重巢式RT-PCR 法。此方法適用于檢測福爾馬林固定的組織，以原位雜交法作對照，結(jié)果顯示二者檢出率完全一致。

在研究豬流行性腹瀉的疾病診斷中，近幾年來研究的側(cè)重點(diǎn)主要是ELISA 法和PCR 法，這兩種方法以其實(shí)用性強(qiáng)、高效、快速、準(zhǔn)確而被廣泛應(yīng)用。尤其是PCR 診斷技術(shù)，比ELISA 法更加敏感，特異性也較強(qiáng)。不過，由于受到儀器設(shè)備的限制，分子生物學(xué)的診斷方法目前還不能適合用于臨床診斷，此法不能得到有效的推廣。但隨著研究的不斷深入，分子生物學(xué)診斷技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。總之，建立一種對傳染病高效、敏感、特異、快速、簡單易用而且廉價(jià)的診斷方法有待進(jìn)一步的研究。

[1] 殷震，劉景華主編．動物病毒學(xué)(第二版)[M]．北京：科學(xué)出版社，1997，681-688．

[2] 武三孝．豬流行性腹瀉的病原學(xué)診斷[J]．畜牧與獸醫(yī)，1998（4）：170．

[3] 王繼科，劉長明，馬思奇，等．豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉病毒的免疫電鏡診斷的研究[J]．中國畜禽傳染病，1991（2）：22-26．

[4] C. Chae，O. Kim，C. Choi，[J]．Prevalence of porcine epidemic diarrhea virus and transmissible gastroenteritis virus infection in Korean pigs[J]．Vet. Rec. 147 (2000)606-608.

[5] 林志雄，李樹根，李力復(fù)，等．豬流行性腹瀉微血清中和試驗(yàn)的建立和應(yīng)用[J]．中國獸醫(yī)科技，1994，24(11)：3-4．

[6] Hofmann M, Wyler R: 1988,Propagation of the virus of porcine epidemic diarrhea in cell culture. J Clin Microbiol 26: 2235-2239.

[7] Rodak L，Valicek L，Smid B，et al．An ELISA optimized for porcine epidemic diarrhea virus detection in faeces. Vet Microbiol[J]．2005，105（1）：9-17．

[8] H o u X. L，Y u L.Y，L i u J．Development and evaluation of enzyme-linked immunosorbent assay based on recombinant nucleocapsid protein for detection of porcine epidemic diarrhea（PEDV）antibodies.Vet Microbiol[J]．2007，123（1-3）：86-92．

[9] Kim O，Chae C．Comparison of Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Immunohistochemistry and in situ Hybridization for the Detection of Porcine Epidemic Diarrhea Virus in Pigs [J]Can J Vet Res，2002，66（2）：112-116．

[10] Oh J. S，Song D. S，Yang J. S，et al．Comparison of an enzyme-linked immunosorbent assay with serum neutralization test for serodiagnosis of porcine epidemic diarrhea virus infection[J]．J Vet Sci. 2005，6（4）：349-352．

[11] 于強(qiáng)，王殿瀛，寶華，等．應(yīng)用ELISA間接檢測豬流行性腹瀉抗體的研究[J]．中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)．1987，（2）：149-154．

[12] 陳茹，羅瓊，李樹根，等．間接法Do t-EL ISA 檢測豬流行性腹瀉抗體的研究[J]．中國獸醫(yī)雜志，1997，23（8）：11-13．

[13] Okjin Kim，Chanhee Chae．Comparison of reverse transcription polymerase chain reaction，immunohistochemistry，and in situ hybridization for the detection of porcine epidemic diarrhea virus in pigs [J]．Can J Vet Res，2002（66）：112-116．

[14] Ishikawa K，Sekiguchi H，Ogino T，et al．Direct and rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus by RT-PCR[J]．J Virol Method，1997（69）：191-195．

[15] KDabota S，Sasaki O，Okada N，et al．Detection of porcine epidemic diarrhea virus using polymerase chain reaction and comparison of the nucleocapsid protein genes among strains of the nucleocapsid genes among strains of the virus[J]．J Vet Med Sci，1999，61（7）：827-830．

[16] 楊群，何孔旺，陸承平．應(yīng)用多重RTPCR 方法檢測158 例豬糞樣中的兩種冠狀病毒[J]．中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006（4）：431-435．

[17] Seong-Hee Kim，ln-Joong Kim，Hyun-Mi Pyo，et a1．Multiplex realtime RT-PCR for the simultaneous detection and quantification of transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus[J]．Virol Methods，2007，doi: 10. 1016/j, viromet. 2007. 06. 021.

[18] Kim L，Chang K O，Sestak K．Development of a reverse transcription nested polymerase chain reaction assay for differential diagnosis of transmissible gastroenteritis virus and porcine respiratory coronavirus form feces and nasal swabs of infected pigs[J]．J Vet Diagn Invest，2000，12（4）：385-388．圖片摘自：Emerging Infectious Diseases www.cdc.gov/eid 菾 Vol. 15, No. 7,July 2009