4個傳染性囊病野毒株的致病性試驗

唐德宏,吳永啟,郝明飛,張 帥,孫 見,丁 源,孫淑紅

(1.山東省泰安市畜牧獸醫局,山東 泰安271000;2.山東農業大學動物科技學院,山東 泰安271018)

傳染性囊病(infectious brusal disease,IBD)是由傳染性囊病病毒(infectious brusal disease virus,IBDV)引起的一種急性、高度接觸性、高度傳染性的病毒病。自20世紀 60年代發現傳染性囊病(IBD)以來,給世界養禽業帶來了極大的損失。對養禽業影響更嚴重的是,歐洲國家及我國相繼出現了vvIBDV方面的報道,其致死率達到了100%[1-4]。

我們曾比較了1998～1999年間采集的12個中國野毒株的致病性[5]以及31個1998～2001年間來自我國不同地區的IBDV野毒株[6],闡明了10年前我國雞群中IBDV致病性變化的流行病學規律。為揭示近幾年來IBDV在致病性上的變異動態,本試驗選取了2006～2008年間從山東某地采集表現出IBD臨床癥狀的病雞病料,分離鑒定了4個IBDV野毒株,并分別在5周齡SPF雞進行了致病性的比較。

1 材料與方法

1.1 SPF雞胚、SPF雞 購自山東濟南賽斯家禽有限公司。

1.2 毒株 4個野毒株,分別來自2006～2008年的山東某地收集的原始腔上囊病料。分別取腔上囊病料稱重,加4倍滅菌PBS(p H值7.4)研磨,凍融3次。懸液加20%氯仿混勻作用20 min,4 000 r/min離心10 min。并重復1次,加雙抗至終濃度4 000 IU/mL。放置4℃過夜。

將處理的病料再接種4～6只4周齡SPF雞傳代,3～4 d后不論是否死亡均采集腔上囊,混合研磨后再按如上處理繼續傳代。將傳代3次并經處理后的腔上囊懸液用無菌離心管分裝,放置-20℃待用。分別用作測定ELD50、EID50及人工感染雞的試驗。試驗時每次取用一管,不重復使用。

1.3 SPF雞感染方法 分別用4周齡SPF雞,每只雞接種不同毒株的病毒液0.2 mL,點眼、滴鼻各0.1 mL。觀察6 d內雞的死亡數,并對6 d后存活雞進行剖檢,記錄腔上囊/體重、胸腺/體重的百分數。

1.4 ELD50和 EID50的測定比較 分別用7 d的SPF雞胚采用卵黃囊接種法進行接種。不同的IBDV毒株分別按10倍倍比稀釋至10-6,每個稀釋度接種6個雞胚,每胚接種0.1 mL。剔除24 h內死亡的雞胚。以后12 h照胚2次,觀察至 144 h,然后根據Reed-Muench計算方法計算每株野毒的囊毒懸液的ELD50。

對144 h內死亡或不死亡的雞胚,分別取每個雞胚的部分肝臟、腎臟和脾臟,與p H值7.4的PBS以1∶4比例混合研磨,離心取上清液,采用雞傳染性囊病快速診斷試紙條進行測試是否有IBDV感染,根據Reed-Muench來計算其EID50。傳染性囊病快速診斷試紙條由河南省農業科學院生物技術研究所提供。

1.5 血清中抗體滴度的檢測 采集血清樣品,用Idexx公司提供的IBDV抗體檢測試劑盒進行測定。

1.6 統計學分析所有數據用Student′s t分析。

2 結果

2.1 不同IBDV毒株的ELD50和EID50的測定結果4個傳染性囊病野毒株均可在SPF雞胚上復制并使雞胚致死,但ELD50和EID50呈現一定程度的差異,結果見表1。

表1 4個IBDV野毒株腔上囊懸液中病毒含量

2.2 不同IBDV毒株人工感染SPF雞后對體重的影響 所有毒株人工感染SPF雞后,與對照組相比,均造成生長性能下降,而且隨著感染日齡的增長,體重下降更加明顯。如SD060617株人工感染后7 d,與對照組相比,分別為298.3±40.2(8)vs 324.2±27.6(6),差異不顯著(P＞0.05);人工感染后14 d,分別為 456.4±62.3(8)vs 593.3±44.9(6),差異顯著(P＜0.05)(表略)。

2.3 不同毒株對5周齡SPF雞的致病性 結果見表2。4個IBDV毒株對5周齡SPF雞的易感性不同,但都能引起腔上囊和胸腺不同程度的萎縮。SD070101、SD080101與SD080102等3株IBDV分別以3 000個 EID50人工感染 5周齡 SPF雞,造成的死亡率在10%～20%之間;而SD060617株無致死率,但同樣造成中樞免疫器官的顯著萎縮。

表2 不同毒力的IBDV毒株在同一批次5周齡SPF雞上的致病性

2.4 SD060617株人工感染SPF雞后7 d、14 d對胸腺、腔上囊的抑制作用 結果見表2、表3。感染后7d,與對照組相比,腔上囊與胸腺指數分別為0.16±0.032(8)vs 0.39±0.08(6)、0.27±0.10(8)vs 0.55±0.09(6),差異極顯著(P＜0.01);感染后14 d,腔上囊、胸腺指數分別為0.09±0.02(11)vs 0.42±0.07(6)、0.52±0.13(11)vs 0.81±0.09(6),差異極顯著(P＜0.01)。

表2 SD060617株感染后7 d對中樞免疫器官的抑制作用

表3 SD060617株感染后14 d對中樞免疫器官的抑制作用

2.5 SD060617株人工感染5周齡SPF雞后抗體滴度 對SD060617株人工感染SPF雞4 d、7 d、10 d、13 d的血清抗體進行了檢測,結果表明,人工接種SPF雞后7 d,所有雞只均產生抗IBDV的抗體,接種后13 d內抗體滴度逐漸升高,表明該毒株具有很好的免疫原性。

3 討論

本試驗針對2006～2008年間從山東地區采集表現出IBD臨床癥狀的病雞病料,分離鑒定4個野毒株,并在5周齡SPF雞比較了其致病性變異。結果顯示,以3 000個EID50人工感染5周齡SPF雞,SD070101、SD080101與SD080102等3個IBDV株造成的死亡率分別為20%(4/20)、10%(2/20)、15%(3/20),而SD060617株無致死率為0%(0/20),但同樣造成中樞免疫器官的極顯著萎縮(P＜0.01)。

對SD060617株人工感染SPF雞后4 d、7 d、10 d,13 d的血清抗體的檢測結果表明,人工接種SPF雞后7 d開始,所有雞只均產生抗IBDV抗體,表明該毒株具有很好的免疫原性;對感染后7 d、14 d的中樞免疫器官指數比較發現,該毒株在雞群中可持續引起雞中樞免疫器官的萎縮,雖無雞只死亡,但隨著感染時間的延長,免疫器官受到的損傷更加嚴重。這表明,SD060617株不是強毒株(在其純化3代的過程中也無1只接種雞死亡),而5周齡SPF雞人工感染7 d后即產生IBDV抗體又表明該毒株已誘發了相應的免疫力,是否可以進一步致弱成為疫苗株有待于研究。

本研究表明,強毒株仍然為2006～2008年的主要流行毒株,其在流行病學中所占的比例沒有發現明顯變化。

[1] Brown M D,Skinner M A.Coding sequences of both genome segments of a European“very virulent” infectious bursal disease virus[J].Virus Res,1996,40：1-5.

[2] 李德山,武志強,陳冠春,等.雞傳染性法氏囊病超強毒毒株的分離和初步鑒定[J].中國畜禽傳染病,1991,6：3-6.

[3] 曹永長,畢英佐,梁志清,等.超強傳染性法氏囊病毒毒株宿主保護抗原的分子特征[J].中國獸醫學報,1998,18(6)：521-526.

[4] 崔治中,孫淑紅,單忠芳,等.雞傳染性法氏囊病超強毒株GX8/99株的致病性[J].病毒學報,2002,18(6)：162-166.

[5] 孫淑紅,崔治中,金文杰.雞傳染性法氏囊病病毒 12個野毒株的毒力比較[J].中國獸醫學報,2002,22(6)：539-540.

[6] 孫淑紅,崔治中,金文杰,等.1997～2001年間31個不同傳染性法氏囊病病毒分離株的致病性研究[J].中國預防獸醫學報,2004,26(2)：121-126.