促性腺激素釋放激素受體在濟寧青山羊垂體和卵巢的分布特點

葛仕豪,萬雙秀,王樹迎

(1.菏澤學院動物科學系,山東菏澤274015;2.山東農業(yè)大學動物科技學院,山東泰安271018)

下丘腦合成的促性腺激素釋放激素(GnRH)以脈沖分泌方式到達垂體前葉,調控腺垂體對FSH、LH的合成與分泌[1],GnRH也可直接作用于性腺,調控性腺類固醇激素的分泌,GnRH對生殖功能的調控必須以促性腺激素釋放激素受體(GnRHR)為介導[2]。近年來,GnRH R的分布、表達、調節(jié)等在神經內分泌、生殖生物學領域得到了深入的研究,但對GnRHR在青山羊垂體和卵巢內的分布卻未見有報道,因此我們以高繁殖力的濟寧青山羊為研究對象,探討GnRH R在其垂體和卵巢內的形態(tài)結構及分布規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 選取臨床健康、未孕雌性濟寧青山羊6只,年齡2～3歲,體重約20 kg。

1.2 取材制片 于2008年9月份宰殺發(fā)情期和間情期的濟寧青山羊各3只,在發(fā)情期取垂體和卵巢,而間情期只取卵巢,分別放入4%多聚甲醛固定,經梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,連續(xù)切片,片厚4～6μm,垂體和卵巢組織塊每隔10片連續(xù)取2片,分為兩套切,其中一套用于GnRH R免疫組化SABC染色,另一套用作陰性對照試驗。

1.3 免疫組化SABC法染色程序 (1)切片脫蠟至水后,室溫條件下 3%H 2O2作用 15 min。(2)微波修復2次后用正常山羊血清室溫下封閉30 min。(3)加入兔抗GnRHR血清(1∶150),然后4℃過夜。(4)加入生物素標記的羊抗兔IgG 37℃下30 min。(5)加入SABC復合物37℃下作用30 min。(6)DAB鏡下顯色5～10 min。(7)蘇木素輕度復染,脫水,透明,封片。以上試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。

對照試驗用正常山羊血清封閉液代替一抗,其余步驟同上。

1.4 圖像分析 采用美國Media Cybernetic公司生產的Image-Pro Plus圖像分析軟件(Version 4.1)對垂體和卵巢進行圖像分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析處理 免疫組化圖像分析所得數(shù)據(jù)用EXCEL2003進行統(tǒng)計,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差(±S)表示,用 SPSS 13.0進行 t檢驗和單因子方差分析。

2 結果

2.1 垂體中GnRHR免疫反應陽性細胞 處于發(fā)情期的濟寧青山羊腺垂體內存在大量GnRH R免疫反應陽性細胞,約占細胞總數(shù)的31.5%(表1),細胞呈圓形、梭形、三角形等(見中插彩版圖1)。

表1 濟寧青山羊腺垂體和卵巢內GnRHR陽性細胞比和平均光密度

2.2 卵巢中GnRHR免疫反應陽性細胞 在發(fā)情期,原始卵泡和初級卵泡內未發(fā)現(xiàn)GnRHR陽性細胞,但其存在于次級卵泡和成熟卵泡的顆粒層細胞,呈黃色或棕黃色,而在卵泡膜細胞染色較淡或不著色(見中插彩版圖2～5)。在間情期,黃體中的陽性物質主要見于粒黃體細胞,膜黃體細胞未見,白體和閉鎖卵泡中也存在GnRH R陽性細胞(見中插彩版圖6～8)。

次級卵泡內GnRHR陽性細胞比顯著低于成熟卵泡(P＜0.05),但平均光密度無明顯差異(P＞0.05)。黃體中的粒黃體細胞也表現(xiàn)出較強的反應強度,其陽性細胞比與次級卵泡相比無明顯差異(P＞0.05)(表1)。

3 討論

3.1 GnRHR在垂體內的作用及分布 Szende B[3]和Stenfano La ROsa[4]等分別對大鼠和人的GnRHR陽性細胞在腺垂體內的分布進行了研究,他們都在遠側部的促性腺激素(GTH)細胞上發(fā)現(xiàn)有GnRHR陽性物質存在,在神經垂體未發(fā)現(xiàn),這和筆者得出的結論相似。筆者認為在發(fā)情期GnRH通過結合GnRHR,以促進GTH的分泌,從而間接促使卵巢內卵泡的發(fā)育成熟并排卵。

3.2 GnRHR在卵巢內的作用及分布 濟寧青山羊原始卵泡和初級卵泡都未發(fā)現(xiàn)GnRH R陽性細胞,Choi J H等[5]在人的原始卵泡和早期囊狀卵泡也沒有發(fā)現(xiàn)GnRHR,說明GnRH對此階段的卵泡可能沒有調控作用。從次級卵泡到成熟卵泡,卵巢顆粒層細胞開始出現(xiàn)GnRHR陽性物質,并且隨著卵泡的發(fā)育,陽性細胞比逐漸增大,說明GnRH對卵巢性腺類固醇激素的分泌調控能力也逐漸增強,從而促進濟寧青山羊發(fā)情并排卵。Kogo H等[6]研究了鼠卵巢的GnRHR mRNA,發(fā)現(xiàn)其也主要集中分布于卵巢顆粒層細胞,而在卵母細胞和膜細胞未見。濟寧青山羊次級卵泡和成熟卵泡GnRHR陽性細胞平均光密度無差異,筆者推斷,GnRH與Gn-RHR在濟寧青山羊次級卵泡與成熟卵泡的結合能力相似。

Choi J H等[5]用免疫組織化學方法研究發(fā)現(xiàn),在人的卵巢粒黃體細胞發(fā)現(xiàn)有GnRHR陽性物質,而在膜黃體細胞未發(fā)現(xiàn),本試驗結果與之相似。粒黃體細胞具有分泌性激素的作用,因此筆者認為,GnRH通過與黃體內的GnRHR結合,調控間情期孕酮的分泌。黃體退化后形成白體,濟寧青山羊白體和閉鎖卵泡內有少量的GnRHR陽性細胞,其是否參與了卵泡的閉鎖機制尚有待于進一步研究。

[1] Robert Grosse,Andrea Schmid,Torsten Schoneberg,et al.Gonadotropin-releasing hormone receptor initiates multiple signaling pathways by ex clusively coupling to Gq/11 p roteins[J].The Journal of Biological Chemistry,2000,275(13)：9193-9200.

[2] Claytoy R N,Catt K J.Gonad otropin-releasing hormone receptor：charaterization,phy siological regulation,and relationship to reproductive function[J].Endocr Rev,1981,2：186.

[3] Szende B,Srkalovic G,Timar J,et al.Localization of receptors for luteinizing hormone-releasing hormone in pancreatic and mammary cancer cells[J].Proc Natl Acad Sci,1991,88：4153-4156.

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[5] Choi J H,Gilks CB,Auersperg N,et al.Immunolocalization of Gonadotropin-Releasing Hormone(Gn RH)-I,GnRH-II,and Type-I GnRH Receptor during Follicular Development in the Human Ovary[J].The Endocrine Society,2006,9：1-30.

[6] Kogo H,Fujimoto T,Park M K,et al.Gonad otropin-releasing hormone receptor m RNA expression in the ovaries of neonatal and adult rats[J].Cells Tissues Organs,1999,164：14-22.