迪卡蛋雞J亞群禽白血病繼發感染葡萄球菌的診斷

王彥紅,朱陳娟,劉慧謀,張小榮,劉秀梵

(揚州大學獸醫學院,江蘇 揚州 225009)

1989年Payne L N首次從肉種雞中分離出J亞群禽白血病病毒(ALV-J),國內也有從肉用雞和商品雞等分離出該病毒的報道[2-4]。ALV-J可通過垂直傳播和水平傳播感染雞群,導致很高的死亡率、腫瘤發生、生產性能降低等,造成嚴重損失。同時ALV-J感染雞群后,導致其他疾病的發生。禽葡萄球菌病多由金黃色葡萄球菌引起,在60日齡以下的雛雞以敗血癥型和臍炎型為主,中雛多以皮膚病為主,成年雞易發生關節炎和關節滑膜炎[1]。本病例為J亞群禽白血病繼發感染葡萄球菌,診斷結果匯報如下。

1 材料與方法

1.1 發病情況 2009年12月安徽天長某養殖戶飼養2 500只90日齡的迪卡蛋雞,個別雞出現消瘦,并有零星死亡,病程已有10 d,死亡率約2%～5%。送檢5只病死雞和2只病雞,送檢雞的翅下、翅尖、背部等多處有大小不一的皮膚充血、壞死等現象,這些部位的羽毛易脫落,去除患部羽毛后可見皮膚呈紅紫色,皮下有較多膠凍樣滲出,胸肌肌肉出血。剖檢后主要病理變化是腎蒼黃并嚴重壞死,肝、脾及心等主要組織器官無明顯病變。根據病史和典型剖檢病變,初步診斷為壞疽性皮炎,對本病進行病原檢測。

1.2 病毒學檢測 采集2只病雞的血樣分離出血清,取500μL加入 92μL的10%SDS混勻,再加入8μL蛋白酶K(終濃度200 mg/L),55℃金屬浴30 min。然后加入600μL的酚∶氯仿,劇烈振蕩混勻,12 000 r/min離心5 min,取上清后加入2倍體積的無水乙醇,-20℃放置20 min以上,12 000 r/min離心10 min,去上清,70%乙醇洗滌 2次,干燥后加入30μL RTE,37℃水浴 1 h后,貯存于-20℃備用。以提取DNA為模板,根據 ALV-J原型株HPRS-103的gp85囊膜糖蛋白基因序列設計一對引物[5],用PCR擴增目的片段。PCR反應體系為50μL,其中含1×PCRBuffer,2.5 mmol/L MgCl2,200μmol/L d NTPs,上下游引物濃度各為1.0μmol/L,模板為1 ng?IU DNA 聚合酶;擴增條件為95℃預變性4 min,94℃變性1 min,55℃復性45 s,72℃延伸60 s擴增30個循環;72℃后延伸8 min,4℃保存。循環結束后,取PCR反應產物通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.3 細菌學檢測 將病死或病雞的皮下滲出液、血液、肝等以無菌操作在血液瓊脂平板進行劃線,并采用了厭氧和有氧培養兩種方式,經37℃24 h培養觀察結果,對培養出的菌落涂片,分別用革蘭染色,然后鏡檢。挑取典型菌落在血液瓊脂平板、普通營養瓊脂平板和LB平板上進行純培養,將純培養的細菌進行糖發酵等生化試驗。

1.4 藥敏試驗 采用紙片瓊脂擴散法,藥敏紙片系杭州天和微生物試劑有限公司產品,操作方法和判定標準參照該公司操作方法與標準。藥敏紙片有：亞胺硫酶素、妥布霉素、環丙沙星、青霉素、丁胺卡那霉素、羧芐青霉素、鏈霉素、菌必治、新霉素、美洛西林、潔霉素、多粘菌素、氨曲南、奧格門汀、復方新諾敏、慶大霉素。

2 結果

2.1 病毒學檢測 2只病雞血液中血清經分離后,提取DNA后,經PCR擴增出約930 bp的目的片段,與預期的目的片段大小一致(圖1),因此,血清中含有ALV-J。

2.2 細菌學檢測 在厭氧和有氧培養條件下,病死或發病雞的血液和肝等病料無菌取樣后在血液瓊脂平板上均未有細菌生長,皮下滲出液在血液瓊脂平板上均出現白色的圓形菌落,而且生長良好,革蘭染色后觀察為革蘭陽性球菌,呈葡萄串狀排列。在普通營養瓊脂平板和LB平板上生長良好,在血液瓊脂平板上呈β-溶血。生化試驗結果顯示,該菌能分解乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖,產酸不產氣;能分解甘露醇,產酸。細菌生長特點、形態及生化試驗結果表明該分離菌為葡萄球菌。

2.3 藥敏試驗 藥敏試驗結果顯示,分離菌僅對丁胺卡那霉素和美洛西林敏感;對菌必治介于敏感和耐藥之間,對其余藥物均耐藥。

圖1 gp85基因的PCR產物電泳圖

3 討論與小結

根據本病的典型剖檢病變,初步診斷為壞疽性皮炎,對送檢病例進行病原分離和快速診斷方法進行實驗室診斷,經病毒學檢測和細菌學檢測結果顯示該病雞為J亞群禽白血病繼發感染葡萄球菌。迪卡白系蛋雞產蛋性能好,養殖戶用它生產非免疫胚,效益比普通蛋雞更高,但是它作為引進品種在抗病力上比中國本土品種要差得多,更易感染J亞群禽白血病。雖然各個種禽公司加強禽白血病的凈化工作,但在我國養禽業高度發展,隨著各種商品雞的J亞群禽白血病發病率增高[3-4],給禽白血病凈化工作增加了難度,對該病的流行控制也提出了新的要求。目前國內外建立了多種ALV-J檢測方法,本室在Smith L M等[5]研究基礎上建立了快速診斷ALV-J的PCR方法,能對臨床病例快速高效地進行檢測。

葡萄球菌在臨床上引起雞敗血癥型和關節炎型的情況較為常見,但是壞死性皮炎的病例較為少見,在本病例中由于病雞感染ALV-J后免疫力下降而繼發感染此細菌,分離菌已對青菌素、慶大霉素等藥產生耐藥,該病治療較為困難,建議對雞群進行檢測,已感染ALV-J病雞及時淘汰。

[1] 陳溥言.獸醫傳染病學[M].5版.北京：中國農業出版社,2006：152-155.

[2] Payne L N,Brown S R,Bumstead N,et al.A novel subgroup of exogenous avian leukosis virus in chick ens[J].Journal of General Virology,1991,72：801-807.

[3] 杜巖,崔治中,秦愛建,等.從市場商品肉雞中檢出 J亞群禽白血病病毒[J].中國家禽,1999,1：1-4.

[4] 徐鑌蕊,呂艷麗,董衛星,等.雞骨髓細胞瘤病的病理學診斷[J].畜牧獸醫學報,2002,33(6)：562-564.

[5] Smith L M,Brown S R,Howes K,et al.Development and application of polymerasechain reaction(PCR)tests for thedetection of Subgroup J Avian Leukosis Virus[J].Virus Res,1998,54(1)：87-98.