急性壞死性胰腺炎大鼠腸道Cajal間質細胞以及c-kit mRNA表達的改變

石亮亮 劉明東 陳敏 鄒曉平

·論著·

急性壞死性胰腺炎大鼠腸道Cajal間質細胞以及c-kit mRNA表達的改變

石亮亮 劉明東 陳敏 鄒曉平

目的檢測急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠小腸組織中Cajal間質細胞(ICC)的改變，探討其參與胃腸道動力障礙的機制。方法24只雄性SD大鼠按數字表法隨機分為ANP組和對照組，各12只。采用膽總管逆行注射5%牛磺膽酸鈉建立ANP大鼠模型。術后23 h自胃管注入美藍1.0 ml，1 h后處死大鼠，測量幽門至藍染距離，計算活體腸道推進率；胰腺和小腸組織常規病理檢查；應用免疫組化和實時PCR法檢測ICC標志物酪氨酸激酶(c-kit)蛋白及mRNA的表達；應用透射電鏡觀察ICC超微結構改變。結果ANP組胰腺腺泡細胞小葉結構破壞，片狀出血，灶性壞死，大量炎癥細胞浸潤；小腸黏膜水腫、糜爛，炎癥細胞浸潤。ANP組腸道推進率為(41.55±3.85)%，較對照組的(68.66±2.66)%顯著下降(P<0.05)；c-kit陽性細胞數較對照組減少(56.11±5.09對88.47±4.49，P<0.05)；c-kit mRNA表達亦較對照組下降(0.64±0.33對1.29±0.91，P<0.05)。ANP組ICC的線粒體空泡變，周圍突起減少，與平滑肌細胞之間的連接結構不清。結論ICC減少和超微結構改變是ANP時胃腸道動力障礙的重要機制之一，而ICC的這些改變可能是由于c-kit基因表達下降所致。

胰腺炎，急性壞死性； 小腸； Cajal間質細胞

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)早期即出現胃腸動力障礙。Cajal間質細胞(interstitial cells of cajal,ICC)具有胃腸起搏功能并能調節神經遞質傳遞，在胃腸電活動及動力發生中有著重要的作用。本研究觀察急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠腸道ICC的變化，探討其在ANP時胃腸道動力障礙發生中的作用。

材料與方法

一、實驗動物及分組

雄性SD大鼠(200～250 g)24只，清潔級，購自南京鼓樓醫院實驗動物中心，適應性飼養1周。按數字表法隨機分為ANP組和對照組，各12只。采用膽總管逆行注射5%牛磺膽酸鈉1. 0 ml/kg體重建立大鼠ANP模型。對照組大鼠在開腹后僅翻動十二指腸并觸摸胰腺數次后關腹。

二、大鼠腸道動力測定

術后23 h自胃管注入美藍1.0 ml，1 h后處死大鼠，取出小腸，測量幽門至藍染距離，計算活體腸道推進率(所測距離/幽門至回盲部小腸總長度×100%)，以此判斷胃腸道轉運功能。

三、胰腺及小腸組織病理學檢查

取大鼠胰腺組織和曲氏韌帶下5 cm的小腸組織，常規行病理學檢查。

四、ICC標志物酪氨酸激酶(c-kit)蛋白及mRNA檢測

小腸固定標本經蔗糖梯度脫水、OCT包埋、切片，采用免疫組化法檢測c-kit蛋白。棕色的細胞為陽性細胞。通過Image pro plus 6.0軟件半定量計算陽性面積A值表示c-kit陽性細胞數量。

新鮮小腸組織用Trizol抽提總RNA。c-kit上游引物5′-TGGATCAGCAAATGTCACAACAAC-3′，下游引物5′-TAGGCCTCGAACTCAACAACCA-3′，擴增片段132 bp；β-actin上游引物5′-TCGTGCGTGACATTAAAGAG-3′， 下游引物5′-ATTGCCGATAGTGATGACCT-3′，擴增片段134 bp。引物由寶生物工程有限公司設計合成。以1 μg總RNA為模板，應用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄合成cDNA。于ABI PRISM 7500熒光實時定量PCR儀上行PCR擴增反應。反應條件： 95℃ 10 s，95℃ 5 s、60℃ 34 s，45個循環；溶解曲線分析：95℃ 15 s,60℃ 60 s，95℃ 15 s。每個樣本重復3次，取Ct平均值，c-kit mRNA相對表達量用2-△△Ct法計算。

五、回腸ICC超微結構觀察

沿縱軸剖開小腸，在裝有Kreb′s液的燒杯中取出腸內容物，立即置入5%的戊二醛中固定，固定后將組織切成1 mm×5 mm的條，用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液沖洗，用2%的四氧化鋨固定2 h后，再用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液沖洗，然后在丙酮中梯度脫水，通過浸透、樹脂聚合、精確定位后進行超薄切片，用1%醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色后，透射電鏡觀察。

六、統計學方法

結 果

一、胰腺和小腸的病理形態學改變

對照組大鼠無死亡，胰腺和小腸結構正常。ANP組死亡2只，牛磺膽酸鈉注射后即可見胰腺明顯充血、水腫，24 h后開腹可見胰腺出血、壞死，部分有血性腹水形成，光鏡下可見胰腺腺泡細胞間隙增寬，小葉結構破壞，片狀出血，灶狀壞死，大量炎癥細胞浸潤(圖1)；小腸黏膜水腫、糜爛，腺體結構紊亂，炎癥細胞浸潤(圖2)。

二、胃腸道動力改變

ANP組大鼠胃腸道脹氣明顯，腸道內大量滲出液。ANP組活體腸道推進率為(41.55±3.85)%，較對照組的(68.66±2.66)%明顯下降(P<0.05)。

圖1 對照組(a)和ANP組(b)胰腺組織病理改變(HE ×200)

圖2 對照組(a)和ANP組(b)小腸組織病理改變(HE ×100)

三、腸道c-kit蛋白及mRNA的表達

c-kit蛋白定位于黏膜下內環肌層表面以及環肌層和縱肌層之間的肌間神經叢的ICC胞質內，呈棕黃色(圖3)。對照組c-kit的平均A值為88.47±4.49，ANP組為56.11±5.09，較對照組明顯減少(P<0.05)。對照組c-kit mRNA表達量為1.29±0.91，ANP組為0.64±0.33，亦較對照組明顯減少(P<0.05)。

四、ICC超微結構的變化

對照組的ICC形態為三角形或梭形,細胞核比較大，周圍包繞少量胞質,胞質的電子密度高于周圍的其他細胞，且有長的突起圍繞著神經節的外圍，并與平滑肌細胞連接(圖4a)。ANP組ICC的線粒體空泡變，周圍突起減少，與平滑肌細胞之間的連接結構不清(圖4b)。

圖3對照組(a)和ANP組(b)小腸組織內c-kit陽性表達細胞(免疫組化 ×200)

討 論

研究表明，胰腺壞死組織感染的細菌大部分來源于腸道[1]。細菌易位的主要機制是SAP時胃腸道運動功能的改變導致腸道內細菌的滯留和過度繁殖，再加上腸道屏障破壞所致[2]。近年臨床研究發現，胃腸功能恢復早者，病情好轉較快[3]。因此，改善胃腸道動力對SAP患者預后有著重要的影響。

圖4 對照組(a)和ANP組(b)ICC的超微結構改變

c-kit/SCF信號通路在ICC發育和維持中有著重要的作用[4-5]。研究表明，ICC的數目和分布的異常與眾多胃腸道動力障礙性疾病，如Hirschsprung′S病、Chagas′病、先天性巨結腸、少年肥厚型幽門梗阻、慢傳輸性便秘等有關。王廣勇等[6]報道，急性壞死性胰腺炎豚鼠胃腸動力減弱，小腸肌間神經叢c-kit陽性細胞數減少。本實驗結果亦顯示，ANP組大鼠小腸c-kit陽性細胞數較對照組減少，小腸c-kit mRNA表達量亦較對照組明顯下降，表明ANP時ICC的c-kit mRNA及蛋白表達的減少參與胃腸道動力障礙機制。

樓征等[7]報道，腹腔感染和腹腔高壓大鼠模型的回腸肌間神經叢的ICC的超微結構發生改變。本實驗結果顯示，ANP組ICC的線粒體發生空泡化，ICC的胞質突起減少，與平滑肌細胞之間的連接結構不清。與Filipoiu等[8]的結果一致。ICC內線粒體空泡化勢必影響ICC的能量代謝，從而影響其功能的正常發揮。ICC可與腸運動神經元釋放的乙酰膽堿結合，并通過平滑肌細胞的縫隙連接產生興奮性連接電位，使平滑肌細胞收縮，ANP時ICC與平滑肌縫隙連接的破壞，導致平滑肌收縮功能降低。

總之，ICC減少和超微結構改變是ANP時胃腸道動力障礙的重要機制之一，而ICC的這些改變可能是由于c-kit基因表達的下降所致。至于ICC與其他參與胃腸動力改變的因素是否相關還有待進一步研究。

[1] Wang X, Wang B, Wu J, et al. Beneficial effects of growth hormone on bacterial translocation during the course of acute necrotizing pancreatitis in rats. Pancreas,2001, 23: 148-156.

[2] Foitzik T.The enteral factor in pancreatic infection.Pancreatology,2001, 1:217-223.

[3] 張鈺鵬,孫家邦,李非.急性胰腺炎時腸道動力抑制及其臨床意義.中國家庭醫學研究雜志,2000, 2:4-6.

[4] Hirota S, Isozaki K, Nishida T,et al. Effects of loss-of function and gain-of-function mutations of c-kit on the gastrointestinal tract. J Gastroenterol,2000, 35:75-79.

[5] Lecoin L, Gabella G, Le Douarin N. Origin of the c-kit-positive interstitial cells in the avian bowel. Development,1996, 122:725-733.

[6] 王廣勇,李兆申,高峻,等.Cajal間質細胞和腸神經元在急性壞死性胰腺炎豚鼠小腸組織中的改變.胰腺病學,2007,7:394-396.

[7] 樓征,黎介壽.腹腔感染和腹腔高壓對腸道Cajal間質細胞的影響.中華胃腸外科雜志,2008,11:256-260.

[8] Filipoiu F, Lupu G, Tarta E, et al.Cajal Interstitial cells identification.Rev Med Chir Soc Med Nat Lasi,2002,106:142-146.

2010-03-16)

(本文編輯：呂芳萍)

ChangesofinterstitialcellsofCajalandc-kitmRNAexpressioninjejunumofratsofexperimentalacutenecrotizingpancreatitis

SHILiang-liang,LIUMing-dong,CHENMin,ZOUXiao-ping.

DrumTowerClinicalMedicalCollege,NanjingMedicalUniversity,Nanjing210008,China

ZOUXiao-ping,Email:zouxiaoping795@hotmail.com

ObjectiveTo observe the changes of Interstitial cells of Cajal (ICC) and c-kit mRNA expression in jejunum of rats of experimental acute necrotizing pancreatitis (ANP), and to investigate its possible mechanism of gastrointestinal dysmotility.Methods24 male SD rats were randomly divided into ANP group and control group with 12 rats in each group. ANP rats were induced by choledochal retrograde injection of 5% sodium taurocholate. 1.0 ml of methylene blue was injected through gastric tube 23 h after induction, and 1 h later the rats were sacrificed. The distance from pylorus to methylene blue stained place was measured, and intestinal motility was assessed by testing small intestinal propulsion rate. Pancreatic and intestinal tissues were routinely sent to pathological examination. Immunohistochemical staining and RT-PCR method was used to detect the c-kit protein and mRNA expression of ICC in jejunum. Ultrastructures of ICC were evaluated by transmission electron microscopy.ResultsDestroyed lobular structure of pancreatic acinar cells, flake bleeding and focal necrosis, large amount of inflammatory cell infiltration was observed; mucosal edema, erosion and inflammatory cell infiltration was also observed. Compared with control group, the small intestinal propulsion rate of ANP group decreased significantly [(41.55±3.85)%vs(68.66±2.66)%,P<0.05)], fewer positive c-kit area (56.11±5.09vs88.47±4.49,P<0.05) and fewer c-kit mRNA expression (0.64±0.33vs1.29±0.91,P<0.05) was detected. Vacuolation of mitochondria of ICC in ANP group and decreased surrounding apophyses, vague connecting structure with adjacent smooth muscle cells were observed.

ConclusionsDecrease of ICC and ultrastructural changes play an important role in intestinal dysmotility during ANP, and the changes of ICC may be resulted from the reduced expression of c-kit gene.

Pancreatitis, acute necrotizing; Intestine, small; Interstitial cells of Cajal

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.06.009

210008 南京，南京醫科大學附屬鼓樓臨床醫學院(石亮亮)；南京醫科大學附屬鼓樓醫院消化科(劉明東、陳敏、鄒曉平)

鄒曉平，Email:zouxiaoping795@hotmail.com