DNA甲基轉移酶1在胰腺癌組織中的表達及其臨床意義

張尤歷 徐岷 高道鍵 張玉琦 高軍 杜奕奇 龔燕芳 滿曉華 李兆申

·論著·

DNA甲基轉移酶1在胰腺癌組織中的表達及其臨床意義

張尤歷 徐岷 高道鍵 張玉琦 高軍 杜奕奇 龔燕芳 滿曉華 李兆申

目的探討DNA甲基轉移酶1(DNMT1)在胰腺癌組織中的表達及其臨床意義。方法收集手術切除的30例胰腺癌組織和配對癌旁組織。采用實時定量PCR法檢測DNMT1 mRNA的表達；免疫組織化學法檢測DNMT1蛋白的表達；分析胰腺癌組織DNMT1蛋白表達強度與臨床病理參數之間的關系。結果胰腺癌組織中DNMT1 mRNA 的表達量為2.32(1.17～5.17)，顯著高于配對癌旁組織的0.78(0.07～3.14，P<0.05)。胰腺癌組織中導管細胞DNMT1蛋白表達陽性率為(54.5±21.2)%，顯著高于癌旁組織(10.9±15.0)%的表達陽性率(P<0.01)。以胰腺癌導管細胞DNMT1陽性率54.5%為界，分為高表達組(19例)和低表達組(11例)。DNMT1表達強度和臨床分期(χ2=6.897,P=0.029)、淋巴結轉移(χ2=4.739,P=0.029)、神經浸潤與否(χ2=5.44,P=0.020)相關，而與年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小、腫瘤分化、血清CEA和CA19-9濃度無關。結論胰腺癌組織DNMT1 mRNA和蛋白表達明顯增加，DNMT1蛋白表達強度與胰腺癌的侵襲力、淋巴結轉移和神經浸潤相關。

胰腺腫瘤； DNA甲基轉移酶1(DNMT1)； 免疫組織化學

表觀遺傳學研究DNA甲基化狀態、組蛋白修飾、基因組印跡、染色體修飾及microRNA調控狀態等問題，其中DNA甲基化是哺乳動物基因組發生的最常見的一種表觀遺傳學事件。目前DNA甲基化與腫瘤的關系成為腫瘤分子生物學研究的熱點之一[1]。DNA甲基轉移酶1(DNMT1)是哺乳動物細胞中含量最多的DNA甲基化轉移酶，它在多種腫瘤組織中的表達明顯上調，其發生往往先于甲基化狀態的異常，因而是腫瘤細胞具有特征的早期分子改變[2-3]。本研究檢測胰腺癌組織和相應癌旁組織中DNMT1 mRNA和蛋白表達，探討其在胰腺癌發生、發展中的作用機制。

材料和方法

一、材料

收集2006年1月至2008年3月長海醫院手術治療的30例患者，其中男16例，女14例，年齡38～86歲，平均(59±12)歲。患者術前均未行化療和放療，均經病理診斷為胰腺導管腺癌。以第二軍醫大學胰腺疾病研究所保存的5例正常胰腺組織作為對照。獲取組織標本均取得家屬同意，并簽署書面知情同意書。

二、方法

1．實時定量PCR法檢測DNMT1 mRNA的表達：Trizol法提取組織總RNA，用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄。DNMT1上游引物：5′-GTGGGGGACTGTGTCTCTGT-3′，下游引物：5′-TGAAAGCTGCATGTCCTCAC-3′，擴增片段204 bp； GAPDH上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物：5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3′，擴增片段142 bp。擴增條件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 45 s，共40 個循環。實驗重復3 次。以GAPDH作為內參照。相對表達量(RQ值) = 2-ΔΔCT，以正常胰腺組織DNMT1 mRNA表達量的均數為1，計算癌組織和癌旁組織中DNMT1 mRNA 的相對表達量。

2．免疫組織化學法檢測DNMT1蛋白的表達：按SP試劑盒說明書操作。兔抗人DNMT1多克隆IgG抗體(Abcom公司)工作濃度1∶100。PBS代替一抗作為陰性對照，用已知DNMT1表達陽性的胃癌標本作為陽性對照。染色結果判斷：胞核染色為陽性。每張切片于高倍鏡下隨機計數至少500個導管細胞，陽性細胞數/總計數細胞數×100%表示陽性表達率。

三、統計學處理

結 果

一、胰腺癌組織中DNMT1 mRNA的表達

30例胰腺癌組織中DNMT1 mRNA的表達量為1.17～5.17，平均2.32，配對癌旁組織為0.07～3.14，平均0.78，兩者相差顯著(P<0.05)。

二、胰腺癌組織中DNMT1蛋白的表達

DNMT1定位于導管細胞的胞核，呈棕黃色。胰腺癌內見大量導管細胞表達DNMT1(圖1a)，表達陽性率為(54.5±21.2)%，配對癌旁組織僅少數細胞表達(圖1b)，陽性率為(10.9±15.0)%，相差顯著(P<0.01)。

三、DNMT1蛋白表達強度與臨床病理參數的關系

以導管細胞DNMT1表達陽性率54.5%為界，分為DNMT1高表達組(19例)和DNMT1低表達組(11例)。DNMT1蛋白表達強度與臨床分期、淋巴結轉移、神經浸潤相關，而與年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小、腫瘤分化、血清CEA和CA19-9濃度均無關(表1)。

圖1胰腺癌組織(a)和配對癌旁組織(b)中DNMT1蛋白表達(SP ×200)

表1DNMT1蛋白表達強度與胰腺癌患者臨床病理參數的關系

參 數DNMT1蛋白高表達(19例)低表達(11例)χ2P值性別(例) 男1060.919 女95年齡(歲)60±1259±130.700腫瘤位置(例) 胰頭1481.000 胰體尾53腫瘤大小(cm)4.00(3.25～4.75)3.50(3.13～3.88)0.213臨床分期(例) Ⅰ266.8970.029 Ⅱ42 Ⅲ133腫瘤分化(例) 低度340.311 中度145 高度22淋巴結轉移(例) 有1334.7390.029 無68神經浸潤(例) 有1545.440.020 無47CEA(ng/ml)5.00(1.99～12.59)2.85(1.80～5.55)0.244CA19-9(ng/ml)173.20(6.11～79.85)320.30(46.01～815.55)0.725

討 論

DNMT家族包括DNMT1、DNMT2、DNMT3a和DNMT3b，其中DNMT1在細胞中含量最多，起著維持DNA甲基化的作用[4]。

文獻報道，胰腺癌、胃癌、腎癌、肝細胞癌、膀胱移行細胞癌、黏液表皮樣癌等腫瘤DNMT1蛋白高表達。Peng等[2]報道，胰腺內無明顯組織學改變及炎癥的組織、有炎癥的組織、上皮內瘤變和導管癌組織中DNMT1蛋白的表達依次增加。Wang等[5]報道，DNMT1的高表達與胰腺癌神經浸潤、腫瘤分化和腫瘤的TNM分期密切相關。本實驗結果顯示，胰腺癌組織中DNMT1 mRNA及蛋白的表達明顯高于配對癌旁組織，DNMT1表達強度與腫瘤臨床分期、淋巴結轉移、神經浸潤相關，與他們的結果一致。

[1] Esteller M. Epigenetics in cancer. N Engl J Med, 2008, 358:1148-1159.

[2] Peng DF, Kanai Y, Sawada M, et al. Increased DNA methyltransferase 1 (DNMT1) protein expression in precancerous conditions and ductal carcinomas of the pancreas. Cancer Sci, 2005, 96:403-408.

[3] Arai E, Kanai Y, Ushijima S, et al. Regional DNA hypermethylation and DNA methyltransferase (DNMT) 1 protein overexpression in both renal tumors and corresponding nontumorous renal tissues. Int J Cancer, 2006, 119:288-296.

[4] Robert MF, Morin S, Beaulieu N, et al. DNMT1 is required to maintain CpG methylation and aberrant gene silencing in human cancer cells. Nat Genet, 2003, 33:61-65.

[5] Wang W, Gao J, Man XH, et al. Significance of DNA methyltransferase-1 and histone deacetylase-1 in pancreatic cancer. Oncol Rep, 2009, 21:1439-1447.

2010-09-16)

(本文編輯：呂芳萍)

ExpressionsandclinicalsignificanceofDNAmethyltransferase1inpancreaticcarcinoma

ZHANGYou-li,XUMin,GAODao-jian,ZHANGYu-qi,GAOJun,DUYi-qi,GONGYan-fang,MANXiao-hua,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang212001,China

LIZhao-shen,Email：zhsli@81890.net

ObjectiveTo investigate the expressions of DNA methyltransferase 1 (DNMT1) in pancreatic carcinoma and its clinical significance.Methods30 samples of pancreatic cancer tissues and paired para-cancerous tissues were collected from patients who underwent curative pancreatectomy. The levels of DNMT1 mRNA were detected by real-time RT-PCR. Expressions of DNMT1 protein were detected by streptavidin peroxidase immunohistochemistry. The relationships between expression of DNMT1 and clinicopathological findings were analyzed.ResultsThe value of relative quantification (RQ) of DNMT1 mRNA in human pancreatic cancer tissues was 2.32 (1.17～5.17), which was significant higher than 0.78 (0.07～3.14) in para-cancerous tissues(P<0.05). The index of expression of DNMT1 protein in human pancreatic cancer tissues was (54.5±21.2)%,which was significant higher than(10.9±15.0)% in para-cancerous tissues (P<0.01). Patients were divided into the high DNMT1 group (n=19) with above 54.5% of the DNMT1 positively cancer cells and the low DNMT1 group (n=11) with less than 54.5% of the DNMT1 positively cancer cells. The high expression of DNMT1 was correlated significantly with clinical staging (χ2=6.897,P=0.029), lymph node metastasis (χ2=4.739,P=0.029) and neural invasion (χ2=5.44,P=0.020). On the other hand, no association between DNMT1 expression and age, gender, tumor location, tumor size, tumor differentiation, the serum CEA and CA19-9 levels could be found.ConclusionsDNMT1 mRNA and protein was highly expressed in pancreatic cancer tissues. High expression of DNMT1 might be related to the aggressiveness of pancreatic cancer, lymph node metastasis and neural invasion.

Pancreatic neoplasms; DNA methyhransferase 1(DNMT1); Immunohistochemistry

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.06.012

江蘇省自然科學基金(BK2009210)；江蘇省衛生廳科研項目(H200836)；鎮江市科研計劃項目(SH2009012)

212001 江蘇鎮江，江蘇大學附屬醫院消化科(張尤歷、徐岷)；第二軍醫大學長海醫院消化科(高道鍵、張玉琦、高軍、杜奕奇、龔燕芳、滿曉華、李兆申)

李兆申，Email：zhsli@81890.net