Bmi-1在胰腺癌組織中的表達及其意義

殷濤 冷振偉 楊智勇 吳河水 王春友

·論著·

Bmi-1在胰腺癌組織中的表達及其意義

殷濤 冷振偉 楊智勇 吳河水 王春友

目的檢測Bmi-1在胰腺癌組織中的表達，分析其與胰腺癌臨床病理特征之間的關系。方法實時熒光定量PCR法檢測22例手術切除的新鮮胰腺癌組織及配對癌旁組織中Bmi-1 mRNA的表達；免疫組織化學法檢測61例胰腺癌石蠟塊標本中Bmi-1、p16蛋白的表達，并分析與臨床病理指標的關系。結果22例胰腺癌組織中Bmi-1 mRNA的相對表達量為0.314±0.040，與配對的癌旁組織0.143±0.056的表達量相差顯著(P<0.01)。61例胰腺癌組織中36例(59.0%)Bmi-1蛋白表達陽性，34例(55.7%)p16蛋白表達缺失。胰腺癌組織Bmi-1的陽性表達與淋巴結轉移相關(P=0.025)；p16的表達缺失與淋巴結的轉移(P=0.020)及腫瘤分化程度(P=0.018)相關；Bmi-1蛋白表達與p16蛋白表達呈負相關(P=0.033)。結論Bmi-1在胰腺癌組織中表達增加，它可能通過抑制p16表達調控胰腺癌的惡性生物學行為。

胰腺腫瘤； 干細胞因子； Bmi-1; 基因，p16; 表達

胰腺癌干細胞學說認為，胰腺癌的發生和發展可能是由特定的腫瘤干細胞樣亞群維系的，一些過度活化的信號通路通過調控胰腺癌干細胞的異常活化進而導致胰腺癌高度惡性的生物學行為。Bmi-1是新近發現的Polycomb蛋白家族成員，也是一種重要的腫瘤干細胞因子， 它在包括胰腺癌在內的多種腫瘤中異常表達，并調控腫瘤的進展[1]。本實驗檢測Bmi-1及其下游基因p16在胰腺癌中的表達，探討其與腫瘤臨床病理指標間的相關性。

材料與方法

一、組織標本

收集2000年至2006年我院手術切除并經病理檢查證實的胰腺癌石蠟塊標本61例。其中37例有淋巴結轉移，9例有遠處轉移；高分化19例，中分化16例，低分化26例。另取3例正常胰腺組織、5例慢性胰腺炎(CP)組織標本作為對照。同時收集22例手術切除的新鮮的胰腺癌組織以及配對的癌旁組織，置液氮保存。

二、免疫組織化學法檢測Bmi-1、p16蛋白表達

SP免疫組化試劑盒購自福州邁新公司，嚴格按照試劑說明書操作。 PBS代替一抗作為陰性對照。 鼠抗人Bmi-1多克隆抗體、兔抗人p16多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，DAB顯色試劑盒購自北京中山生物技術公司。結果判定：胞核或胞質內出現棕黃色顆粒為Bmi-1蛋白陽性表達，在×200光鏡下隨機選取6個視野，每個視野計數50個細胞，以陽性細胞數占總細胞數的百分計算，<10%為陰性，≥10%為陽性。以胞膜和胞質內出現棕黃色顆粒為p16蛋白陽性表達， ≤5%為p16表達缺失，>5%為p16陽性表達。

三、熒光定量PCR法檢測Bmi-1 mRNA表達

采用Trizol(Life Technologies公司)法提取總RNA。 通過逆轉錄反應獲得cDNA，然后行熒光定量PCR。Bmi-1引物為：正義：5′-CTGGTTGCCCATTGACAGC-3′，反義5′-CAGAAAATGAATGCGAGCCA-3′；在FTC-2000型熒光定量PCR儀上進行PCR反應。反應條件：95℃ 10 min，94℃ 30 s ，51℃ 30 s，72℃ 30 s。50個循環。Bmi-1 mRNA的相對表達量采用2-ΔΔCT法[2]計算。

四、統計學分析

p16、Bmi-1相關性分析采用χ2檢驗，表達量的差異性分析采用t檢驗，P<0.05被認為有統計學意義。應用SPSS 15.0 統計軟件包進行數據處理。

結 果

一、Bmi-1 mRNA在胰腺癌組織中的表達

22例胰腺癌組織Bmi-1 mRNA的相對表達量為0.314±0.040，而配對的癌旁組織Bmi-1 mRNA的相對表達量為0.143±0.056，兩者差異具有統計學意義(t=9.758,P<0.0001)。

二、Bmi-1蛋白表達及與胰腺癌臨床病理特征的關系

Bmi-1表達于細胞的胞核和胞質。胰腺癌組織Bmi-1蛋白陽性表達率為59.0%(36/61，圖1)。正常胰腺、癌旁組織及CP組織的Bmi-1均陰性表達。

胰腺癌組織Bmi-1蛋白表達與患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度及遠處轉移均無相關性，僅與淋巴結轉移相關。37例有淋巴結轉移患者中26例Bmi-1蛋白表達陽性，24例無淋巴結轉移患者中10例Bmi-1蛋白表達陽性，兩者相差顯著(P=0.025，表1)。

三、p16 蛋白的表達及與胰腺癌臨床病理特征的關系

正常胰腺組織中p16蛋白表達陽性。 61例胰腺癌組織中34例(55.7%)p16蛋白表達缺失(圖2)，27例(44.3%) p16蛋白陽性表達。p16的表達缺失與淋巴結的轉移(P=0.02)及腫瘤分化程度(P=0.018)相關(表2)。

圖1Bmi-1在胰腺癌中的陽性表達( ×100)圖2p16在胰腺癌中表達缺失( ×100)

表1 胰腺癌組織Bmi-1蛋白表達與臨床病理特征的關系

注：aP<0.05

表2 胰腺癌組織p16 蛋白的表達與臨床病理特征的關系

注：aP< 0.05

四、胰腺癌Bmi-1和p16蛋白表達的相關性

34例p16缺失表達的胰腺癌組織中，24例Bmi-1蛋白表達陽性；27例p16陽性表達的胰腺癌組織中，12例Bmi-1表達陽性。兩者差異具有統計學意義(P=0.033)，同時兩者呈負相關。

討 論

最初發現Bmi-1與癌基因c-myc協同在鼠淋巴瘤的發生過程中發揮作用[3]。隨后的研究證實，Bmi-1通路可以調控白血病干細胞、乳腺癌干細胞的增殖和自我更新能力[4-5]。 現已證實，胰腺癌干細胞的Bmi-1呈活化狀態[6]。本實驗結果顯示，Bmi-1mRNA或蛋白在胰腺癌組織中的表達量都較高，而正常胰腺及CP中則呈陰性表達，進一步證實Bmi-1信號通路在胰腺癌組織中處于異常活化狀態。同時胰腺癌Bmi-1表達與淋巴結轉移相關，表明它參與調控胰腺癌的惡性生物學行為。

p16是一種細胞周期負性調控蛋白，通過對細胞周期依賴激酶CDK的抑制，干擾pRb蛋白的磷酸化，阻滯細胞周期于G1期。p16在多種惡性腫瘤組織的表達呈抑制狀態。本組55.7%的胰腺癌組織p16表達缺失，并與淋巴結的轉移以及腫瘤分化程度相關，提示p16的缺失參與了胰腺癌的進展。

p16是Bmi-1的重要靶基因，Bmi-1的過度活化可導致p16的異常沉默[7]。本實驗結果亦顯示，胰腺癌組織Bmi-1的高表達，而p16的表達被抑制。當然Bmi-1的作用方式非常復雜，它可不依賴于INK4A/ARF[8]而與其他信號通路如NF-κB、PI3K-Akt等協同作用調控腫瘤惡性生物學行為[9-10]。

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2010-01-28)

(本文編輯：屠振興)

ExpressionandsignificanceofBmi1inpancreaticcarcinoma

YINTao,LENGZhen-wei,WUHe-shui,WANGChun-you.

CenterofPancreasSurgery.UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China

YINTao,Email:whuh608@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the expression and significance of Bmi-1 in pancreatic cancer.MethodsThe expression of Bmi-1 mRNA was detected in pancreatic cancer and matched adjacent normal tissues by using real-time PCR in 22 cases of human pancreatic carcinoma. Bmi-1 and p16 protein were determined in 61 cases of human pancreatic carcinoma with immunohistochemistry and their relationship with clinicopathologic parameters was analyzed.ResultsThe expression of Bmi-1 mRNA was 0.314±0.040 in cancerous tissues, and 0.143±0.056 in adjacent normal tissues, and the difference was statistically significant (P<0.01). 36 cases (59.0%) of PC were detected with positive expression of Bmi-1 protein, and 34 cases (55.7%) with no expression of p16 protein. The expression of Bmi-1 was significantly correlated with lymph node metastasis (P=0.020) and tumor differentiation (P=0.018); the expression of Bmi-1 was negatively correlated with the expression of p16 (P=0.033).ConclusionsExpression of Bmi-1 was increased in pancreatic cancer, which may be involved in the malignant behavior of pancreatic cancer by inhibiting p16 expression.

Pancreatic neoplasms; Stem cell factor; Bmi-1; Genes,p16; Expression

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.06.018

國家自然科學基金(30801100)；湖北省生物靶向治療研究重點實驗室開放研究課題(2007B09)

430022 湖北武漢，華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院胰腺外科中心(殷濤、楊智勇、吳河水、王春友)；湖北省生物靶向研究重點實驗室(殷濤)；華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院腔鏡外科中心(冷振偉)

殷濤，Email:whuh608@yahoo.com.cn