胰腺癌SPARC基因甲基化的定量檢測方法

宋健 高軍 杜奕奇 呂順莉 曹佳 龔燕芳 許國銘 李兆申

·技術與方法·

胰腺癌SPARC基因甲基化的定量檢測方法

宋健 高軍 杜奕奇 呂順莉 曹佳 龔燕芳 許國銘 李兆申

DNA甲基化是一種重要的影響基因表達的機制，并與腫瘤發生密切相關[1-3]。研究證實，腫瘤細胞中抑癌基因啟動子部位的CpG島甲基化是腫瘤細胞的基本特征之一，對腫瘤抑癌基因甲基化的檢測有助于腫瘤的早期診斷。循環核酸中抑癌基因甲基化的檢測為胰腺癌的早期診斷帶來了希望，但目前還沒有成熟的可用于臨床的甲基化檢測方法。本研究以胰腺癌SPARC基因為靶標，建立一種可臨床應用的甲基化定量檢測方法。

材料與方法

一、 材料

胰腺癌細胞株PaTu8988、PANC1，健康人白細胞DNA 2份，胰腺癌組織10份，均為本實驗室保存。PCR純化試劑盒、凝膠回收試劑盒及限制性內切酶HpaⅡ、MspI、EX Taq HS Polymeras均購自Takara公司，pGEM-T vector、限制性內切酶Bstz-1、大腸桿菌DH5α購自Promega公司，ABI7500 Real Time PCR儀為美國應用生物系統公司產品。

二、方法

1．胰腺癌細胞株及胰腺癌、癌旁組織DNA抽提：均采用酚-氯仿-異戊醇提取法抽取DNA。

2．DNA的重亞硫酸鹽修飾、修飾后聚合酶鏈式反應(BSP)及產物純化：DNA重亞硫酸鹽修飾和回收純化按EZ-DNA Kit說明進行，修飾后的DNA置-20℃保存。SPARC基因CpG島的BSP引物引用文獻[4]：上游：ATTTAGTTTAGAGTTTTGAGTGG，下游：ACAAAACTTCCCTCCCTTAC，含12個CpG位點。PCR擴增采用降溫PCR程序，擴增后取部分產物行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，部分送基因測序(上海英俊生物工程公司)。PCR產物的純化使用Promega公司的PCR產物純化試劑盒，操作步驟參見說明書。

3．BSP產物的T載體連接、克隆：選取經測序鑒定的完全甲基化和非甲基化的目的基因PCR產物與pGEM-T載體連接，然后轉化大腸桿菌DH5α，進一步培養，采用菌落PCR驗證篩選。并將陽性結果的重組子進行DNA測序，確定目的基因是否正確。同時進行內參基因(ACTB)的T載體連接、克隆及鑒定。

4．SPARC基因甲基化和非甲基化標準品及內參標準品的制備：取保存的含有目的基因質粒的甘油菌50 μl ，接種于5 ml含Amp的LB培養液中，37℃ 250 r/min，振蕩培養過夜至對數生長后期，離心沉淀菌體后，采用堿法或試劑盒抽提質粒標準品。

5．靶基因和內參基因的引物和探針設計：引物設計采用Primer Express軟件(ABI)，內參基因選為ACTB，因其是管家基因，相對穩定。SPARC引物：上游：GTGGTTTTTTGTTGTTTG-TTT；下游:GTAAGGGAGGGAAGTTTTGT；探針：FAM-TAATTTCGATATTTTCGTTTA-MGB；ACTB引物：上游：TGG-TGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT，下游：TAAGGGAGGAGTAGGTTTTATTGGTT；探針：FAM-TTTGTTATTGTGTGTTGGGTGMGB。

6．實時定量PCR對內參及靶基因標準品的檢測：將上述制備的ACTB標準品和SPARC的甲基化標準品質粒稀釋成：106、105、104、103、102(copy/μl)。用上述設計的引物和探針進行實時定量PCR檢測(設復孔)，所有樣品測兩次。

7．定量檢測方法敏感性和穩定性驗證：用上述方法對已行測序的10例胰腺癌組織DNA進行SPARC基因甲基化的定量檢測，并與測序結果進行對比分析，以判定定量檢測方法的敏感性及穩定性。

8．統計學處理：定量檢測結果與測序結果的相關性采用Pearson分析。所有統計學分析均應用SPSS15.0軟件，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、SPARC甲基化和非甲基化標準品及內參標準品制備

通過BSP擴增SPARC基因甲基化和非甲基化的目的片段(第一外顯子區221 bp)及ACTB基因目的片段(133 bp)，與T載體連接，克隆及測序鑒定等，制備了SPARC完全甲基化和非甲基化標準品質粒及內參基因ACTB標準品質粒。SPARC基因菌落PCR產物電泳結果見圖1，其克隆測序結果見圖2。

圖1 SPARC基因菌落PCR電泳圖

圖2 SPARC標準品克隆測序圖

二、SPARC基因及內參標準品和樣品的檢測

106～102 copy/μl SPARC基因甲基化標準品均擴增出良好的曲線(圖3)，10份胰腺癌組織DNA 中8份能擴增出曲線(圖4)，樣品定量拷貝數范圍在1.6～17.2 copy/μl。106～102 copy/μl的ACTB內參標準品均擴增出良好的曲線，10份胰腺癌DNA均擴增出較好的曲線，內參定量范圍在1.5～30455.3 copy/μl。

圖3 SPARC甲基化在標準品中擴增曲線

圖4 SPARC甲基化在樣品中擴增曲線

三、SPARC基因定量檢測與測序結果的對比

前期經BSP法檢測均有SPARC甲基化的10例胰腺癌[5]，本法檢出8例有甲基化，10例胰腺癌組織甲基化定量檢測拷貝數分別為12.0、3.6、0、3.4、1.6、17.2、11.0、4.3、4.3、0 copy/μl，而相應的探針位置CpG位點甲基化率分別為0.625、0.432、0.125、0.467、0.25、0.735、0.567、0.526、0.542、0.329。樣品SPARC基因甲基化的定量檢測拷貝數與測序結果(探針CpG位點甲基化比率)呈正相關(r=0.865,P<0.01)。

討 論

近年來DNA甲基化檢測技術有了很大的發展和完善，位點特異性DNA甲基化檢測方法主要有：甲基化特異性PCR(MSP)、MethyLight、QAMA、微陣列法等[6-9]。但目前還沒有一套敏感、可靠、經濟、簡便的方法可用于臨床的甲基化檢測。我們的研究目的是建立一種在循環DNA中檢測胰腺癌特異甲基化基因的方法。我們曾用測序的方法已證實了胰腺癌外周血中可檢測到特異的甲基化基因[5]，但測序方法繁瑣、效率低，不便于臨床應用，鑒于此種情況，我們選擇了基于MethyLight方法的一種，即BSP引物擴增+TaqMan探針熒光定量PCR方法。該方法技術較為成熟，具有高通量、敏感、可靠等優點，其難點在于擬檢測目的基因靶標的引物和探針設計，及檢測條件的摸索、質控標準等。

本實驗制備了SPARC基因完全甲基化和非甲基化質粒標準品以及內參ACTB質粒標準品，設計了有效的SPARC基因甲基化檢測的引物和探針，并在臨床胰腺癌組織標本中初步進行了驗證，與測序結果的符合率達80%。該方法為甲基化基因的絕對定量法，可以檢測出樣品中靶標基因甲基化的拷貝數，并且檢測數值與測序分析甲基化的比呈明顯正相關，具有較高的敏感性，為下一步在臨床標本中檢測奠定了基礎。但需要進一步研究胰腺癌、慢性胰腺炎和健康人臨床樣品中SPARC基因甲基化的狀況，定出正常值范圍，才能應用于臨床。

(致謝：上海生物芯片國家工程研究中心李明輝博士后，宋娟碩士，周貝貝碩士在實驗過程中給與的幫助和支持，在此表示衷心的感謝！)

[1] Egger G,Liang G,Aparicio A,et al.Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.Nature,2004,429:457-463.

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[5] 宋健，杜奕奇，呂順莉，等.外周血SARP2基因甲基化檢測對胰腺癌的診斷價值.中華胰腺病雜志，2009,9:229-231.

[6] Herman JG，Graft JR，Myohanen S，et al．Methylation-specific PCR：a novel PCR assay for methylation status of CpG islands．Proc Natl Acad Sci USA，1996，93：9821-9826.

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2010-03-25)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.06.028

國家科技部支撐計劃課題(2006BAI02A12)

266071 山東青島，中國人民解放軍第401醫院消化科(宋健)；第二軍醫大學長海醫院消化科(高軍、杜奕奇、呂順莉、曹佳、龔燕芳、許國銘、李兆申)

李兆申，Email: zhsli@81890.net