正交試驗優選苦參總生物堿提取工藝Δ

叢竹鳳，高 鵬，代 龍#（1.山東省腫瘤防治研究院，濟南市 50117；.山東中醫藥大學，濟南市50355）

正交試驗優選苦參總生物堿提取工藝Δ

叢竹鳳1＊，高 鵬2，代 龍2#（1.山東省腫瘤防治研究院，濟南市 250117；2.山東中醫藥大學，濟南市250355）

目的：優選苦參總生物堿的最佳提取工藝。方法：以酸水濃度、溶劑用量、滲漉液流速為考察因素，以苦參中苦參堿、氧化苦參堿含量之和以及總生物堿含量的綜合評分為評價指標，采用正交試驗優選最佳工藝條件。結果：優選的最佳提取工藝為采用10倍量的0.2%鹽酸溶液進行滲漉提取，滲漉速度為3mL·min-1·kg-1。結論：酸水滲漉法操作簡便、提取率高，可用于苦參總生物堿的提取。

苦參；總生物堿；提取工藝；正交試驗

苦參[1]為豆科植物苦參Sophora flavescens Ait.的干燥根，味苦、性寒，歸心、肝、胃、大腸、膀胱經，具有清熱燥濕、殺蟲、利尿等功效。苦參中的有效成分為總生物堿（簡稱總堿），主要有苦參堿（matrine）及氧化苦參堿（oxy-matrine）。現代藥理研究表明[2]，生物堿類成分具有廣泛的生理活性，具有良好的開發應用前景。本試驗比較了不同提取方法對苦參總堿的提取效果，并采用正交試驗法優選最佳提取工藝。

1 儀器與材料

LC-2010A型高效液相色譜（HPLC）儀（日本島津公司）；AB135-S型十萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-250型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；MV1100型紫外分光光度計（上海天美科學儀器有限公司）；PK-S24型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）。

苦參藥材購自山東中醫藥大學門診部，經山東中醫藥大學藥學院生藥系鑒定教研室鑒定為真品；苦參堿、氧化苦參堿對照品、苦參對照藥材（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110805-200306、110780-200306、121019-200505）；乙腈為色譜純，水為2次重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 指標成分的確定

苦參中的主要活性成分為以苦參堿、氧化苦參堿為代表的總堿，因此試驗選擇苦參堿、氧化苦參堿以及苦參總堿的含量為工藝優選的指標成分。

2.2 苦參堿和氧化苦參堿含量測定[3]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-三乙胺磷酸溶液（3∶97，取三乙胺0.3mL、磷酸2mL，加水稀釋至1000mL）；流速：1.0mL·min-1；柱溫：25℃：檢測波長：220nm。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取已干燥至恒重的苦參堿和氧化苦參堿對照品適量，加甲醇分別制成每1mL含苦參堿20μg、氧化苦參堿80μg的溶液，作為混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 分別精密量取提取工藝下的供試品溶液，用流動相稀釋至每1mL相當于含原藥材0.02g，即得。

2.2.4 標準曲線的制備 取苦參堿、氧化苦參堿對照品適量，精密稱定，用甲醇制成每1mL含苦參堿、氧化苦參堿分別為39.02、164.96μg的溶液，作為對照品溶液。分別精密吸取2種對照品溶液1、3、5、7、9μL，注入HPLC儀中，按上述色譜條件測定。分別以苦參堿和氧化苦參堿峰面積積分值（Y）對相應對照品進樣量（X）進行線性回歸，得苦參堿回歸方程為Y＝684270.89X+230.15（r＝0.9999）、氧化苦參堿回歸方程為Y＝699091.60X－3397.3（r＝0.9999）。結果表明，苦參堿、氧化苦參堿進樣量分別在0.03902～0.35118、0.16496～1.48464μg范圍內與各自峰面積積分值呈良好線性關系。

2.2.5 精密度試驗 分別精密吸取混合對照品溶液10μL，進樣5次，按上述色譜條件測定。結果，苦參堿、氧化苦參堿的RSD分別為0.76%、0.82%（n均為5），表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 取供試品溶液10μL，按上述色譜條件每隔1h測定1次，共測6次。結果，苦參堿的RSD＝1.22%（n＝6），氧化苦參堿的RSD＝0.72%（n＝6），表明供試品溶液在5h內穩定。

2.2.7 加樣回收率試驗 取已知苦參堿（1.1042mg）和氧化苦參堿（0.7210mg）含量的同一批樣品6份，精密稱定，分別加入一定量的對照品溶液，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件測定，計算加樣回收率。結果，苦參堿的平均回收率為99.13%，RSD＝1.85（n＝6）；氧化苦參堿的平均回收率為100.97%，RSD＝2.11（n＝6）。

2.3 苦參總堿含量測定

[4]，采用酸性染料比色法——溴甲酚綠顯色法測定藥材以及樣品中的苦參總堿含量（總堿以氧化苦參堿計）。

2.3.1 對照品溶液的制備 取氧化苦參堿對照品適量，精密稱定，加水制成每1mL含氧化苦參堿0.1mg的溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 分別精密量取提取工藝下的供試品溶液，加水稀釋至每1mL相當于含原藥材0.05g，即得。

2.3.3 測定法 參考文獻[4]，選擇420nm波長為最大檢測波長。

2.3.4 標準曲線的制備 精密稱取于120℃干燥至恒重的氧化苦參堿對照品10.20mg，置于100mL量瓶中，加水適量，超聲使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得（每1mL中含氧化苦參堿0.102mg）。精密量取上述對照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，分別置于10mL量瓶中，加水稀釋至刻度。以等量的水作為空白。取各樣品1mL、pH 3.0的緩沖液8mL、溴甲酚綠溶液1mL，振搖后加入CHCl310mL，上下振搖一定時間，靜置。待兩相徹底分離后分取CHCl3層，于420nm波長處測定吸光度（A）。以A為縱坐標、氧化苦參堿檢測濃度（C）為橫坐標，制備標準曲線，得回歸方程為A＝6.3039C+0.0096（r＝0.9996）。結果表明，氧化苦參堿檢測濃度在0.0204～0.1020mg·mL-1范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。

2.3.5 加樣回收率試驗 取已知苦參總堿含量（2.7160mg）的同一批樣品6份，精密稱定，分別加人一定量（2.7026mg）的氧化苦參堿對照品溶液，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算加樣回收率。結果，平均回收率為98.67%，RSD＝2.08%（n＝6）。

2.4 苦參藥材提取工藝預試驗

苦參藥材中苦參堿和氧化苦參堿為中等極性的生物堿。根據苦參生物堿的性質，可以采用的提取方法有水煎煮、乙醇回流、酸水滲漉法。筆者首先對上述3種提取方法進行了預試驗：方法1為取苦參藥材200g，粗粉碎，加8倍量水煎煮2次，每次2h，濾過，合并濾液，備用；方法2為取苦參藥材200g，粗粉碎，加6倍量70%的乙醇回流提取2次，每次1.5h，濾過，合并濾液，備用；方法3為取苦參藥材200g，粗粉碎，采用滲漉法進行提取，控制提取條件為藥材粗粉以10倍量0.2%的鹽酸溶液滲漉，流速為3mL·min-1·kg-1，收集滲漉液，備用。按“2.2”、“2.3”項下方法分別測定苦參堿、氧化苦參堿、苦參總堿的含量，并按下式計算得膏率、總堿轉移率：得膏率＝提取所得干膏質量/原提取藥材總質量×100%；總堿轉移率＝提取出的苦參總堿質量/原藥材中所含總堿質量×100%。預試驗結果見表1。

表1 預試驗結果Tab 1 Pretest results

由表1可知，采用水煎煮、乙醇回流、酸水滲漉法進行提取時的提取效果相當，但對得膏率的影響大小順序為水煎煮法＞乙醇回流法＞酸水滲漉法。從提取液中雜質量及簡化工藝考慮，筆者采用了酸水滲漉法提取苦參總堿，并采用正交試驗法進行了研究。

2.5 酸水滲漉法工藝優選

2.5.1 因素水平的選取 結合預試驗，選取酸水濃度（A）、溶劑用量（B）、滲漉液流速（C）為考察因素，每個因素設3個水平，按L9（34）正交表進行試驗。因素水平見表2。

表2 因素水平Tab 2 Levels and factors

2.5.2 正交試驗結果 準確稱取苦參藥材100g，粉碎成粗粉，共9份。按正交表中各條件分別進行酸水滲漉，共得9份供試品溶液。分別測定其中的苦參堿和氧化苦參堿含量之和以及苦參總堿含量，并分別以苦參堿、氧化苦參堿含量之和以及總堿含量最高值作為10，其余8個數值以最高值按比例折算（即：測定值/最高值×10），二者之和記為綜合得分。正交試驗結果見表3；方差分析結果見表4。

表3 正交試驗結果Tab 3 Results of orthogonal experiment

由表3、表4可知，各因素對滲漉提取影響的大小順序為A＞B＞C，其中酸水濃度有顯著性影響，應選擇其最優水平；溶劑用量、滲漉液流速無顯著性影響，直觀分析優選工藝為A2B2C1。結合工業實際及經驗，滲漉速度選擇水平1速度太慢，選擇水平2即可，故擬定優選工藝為A2B2C2，即藥材粗粉以10倍量0.2%的鹽酸溶液滲漉，流速為3mL·min-1·kg-1。

2.5.3 工藝驗證試驗 根據擬定優選工藝條件，準確稱取苦參藥材200g，共6份，分為A2B2C1組和A2B2C2組，每組3份，按“2.2”、“2.3”項下方法分別測定提取物中苦參堿、氧化苦參堿含量之和及苦參總堿的含量，并進行比較。結果表明，擬定優選工藝與直觀分析優選工藝相當。綜合考慮，選擇A2B2C2，即藥材粗粉以10倍量0.2%的鹽酸溶液滲漉，流速為3mL·min-1·kg-1。驗證試驗結果見表5。

表4 方差分析結果Tab 4 Results of variance analysis

表5 驗證試驗結果Tab 5 Results of validation test

3 討論

苦參及其制劑為臨床常用藥，本試驗選擇苦參作為研究對象具有重要意義。本試驗主要考察了苦參的提取工藝，選擇多個指標性成分對提取方法進行考察，傳統方法中水煎煮法、乙醇回流法和酸水滲漉法對生物堿的提取率相當，但得膏率卻有較大差異，影響順序為水煎煮法＞乙醇回流法＞酸水滲漉法。這說明，采用水煎煮法和乙醇回流法提取總堿時，會帶入大量的雜質，需要進行后續處理方能上柱；而采用酸水滲漉法進行提取時，可以大大減少提取液中的雜質，為后續進一步的精制處理打下基礎。

苦參總堿的含量測定多采用酸性染料比色法，生物堿分子中的仲胺及叔胺基團可以和溴甲酚綠在一定pH條件下產生較強的可見吸收，該測定方法吸收值穩定、結果準確。經過筆者測定，最大吸收波長為420nm，與文獻報道[4]一致。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學工業出版社，2005：141.

[2] 鄭虎占.中藥現代研究與應用[M].北京：學苑出版社，1999：3806.

[3] 王 苑，曾榮仕，朱湛華.RP-HPLC法測定苦參中苦參堿的含量[J].中國藥房，2007，18（27）：2124.

[4] 孟祥松，時 軍.溴甲酚綠比色法測定苦參總堿含量的研究[J].安徽醫藥，2007，11（1）：41.

Optimization of the Extraction Technology of Total Alkaloids from Sophora flavescens by Orthogonal Experiment

CONG Zhu-feng（Shandong Institute of Tumor Prevention Research，Jinan 250117，China）GAO Peng，DAI Long（Shandong University of TCM，Jinan 250355，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of total alkaloids from Sophora flavescens.METHODS：The extraction technology of total alkaloids from S.flavescens was optimized by orthogonal experiment with the concentration of acid water，amount of solvent，velocity of percolation as factors and with the content of matrine and oxymatrine，content of total alkaloids as index.RESULTS：The optimal extraction technology was as follows：10-folds 0.2%hydrochloric acid and the velocity of percolation of 3mL·min-1·kg-1.CONCLUSION：Acid water percolation is simple in operation with high extraction rate.It is suitable for the extraction of total alkaloids.

Sophora flavescens；Total alkaloids；Extraction technology；Orthogonal experiment

R283.2；R284

A

1001-0408（2010）43-4064-03

Δ國家中醫藥管理局新藥開發專項課題（DIX016A）

＊主管藥師，執業藥師，碩士。研究方向：藥物制劑及質量控制。電話：0531-67626447。E-mail：congzhufeng@163.com

#通訊作者：副教授。研究方向：中藥制劑新技術、新劑型。電話：0531-82860367。E-mail：dailongdailong@263.com

2009-10-11

2010-01-21）