那可丁對人胰腺癌BxPC3細胞中HIF-1α及其靶基因VEGF表達的影響

張翠芳 趙秋 柯曉煜 廖宇圣

那可丁對人胰腺癌BxPC3細胞中HIF-1α及其靶基因VEGF表達的影響

張翠芳 趙秋 柯曉煜 廖宇圣

缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)是一種在哺乳動物組織中廣泛存在的轉錄因子,它可誘導VEGF 轉錄活性的增強和表達增加,在腫瘤細胞的能量代謝、血管生成、促進腫瘤增殖和轉移中起重要作用[1]。因此，抑制HIF-1α可能作為惡性腫瘤治療的一個靶點。那可丁(noscapine)是一種阿片類生物堿。最新研究發現，那可丁能阻斷HIF-1α的表達。此外，它還有抗血管形成的作用[2]。本實驗觀察不同濃度的那可丁在氯化鈷(CoCl2)誘導缺氧的狀態下對人胰腺癌細胞株BxPC3細胞中HIF-1α、VEGF基因表達的影響，探討那可丁作為新的化療藥物治療胰腺癌的可行性。

一、材料和方法

1．細胞培養及分組：人胰腺癌BxPC3細胞購于中科院上海細胞庫。常規培養傳代后分常規培養組，缺氧培養組，50、100、150 μmol/L那可丁處理組。缺氧培養是在5 ml含3%胎牛血清培養基中加入0.1 mol/L CoCl2(Sigma公司)母液12.5 μl，在常規培養條件下培養。那可丁處理組是在培養基中加入不同濃度那可丁及CoCl2后常規培養。24 h后采用Trizol一步法提取各組總RNA，用裂解液提取細胞總蛋白。

2．細胞HIF-1α、VEGF mRNA檢測：采用RT-PCR方法。HIF-1α上游序列5′-GATGTAATGCTCCCCTCAC-3′，下游序列5′-GCTGGAATACTGTAACTGTGC-3′，擴增片斷514 bp；VEGF上游序列5′-GAGGGCAGAATCATCACGAAG-3′，下游序列5′-CAGGCCCTCTTCTCATGGTA-3′，擴增片斷402 bp；內參β-actin上游序列5′-GTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，下游序列5′-GACTGCTGTCACCTTCACCGT-3′，擴增片斷157 bp。引物由上海Sangon生物工程有限公司合成。先逆轉錄合成cDNA，再行PCR。反應條件：94℃ 3 min，94℃ 45 s，59℃ 45 s，72℃ 45 s，31個循環，72℃延伸10 min。PCR產物行瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像系統(上海培清科技有限公司)掃描，以目的條帶與內參條帶光密度值之比作為mRNA相對表達量。

3．細胞HIF-1α、VEGF蛋白檢測：采用Western blotting方法。鼠抗人HIF-1α單抗(Abcam公司)1∶ 300稀釋，兔抗人VEGF多抗和鼠抗人β-actin多抗(Bioscience公司)均1∶100稀釋，HRP標記的羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG 1∶3000稀釋，最后ECL顯色，暗房曝光，洗片。

二、結果

1．細胞HIF-1α、VEGF mRNA表達的變化：常規組、缺氧組和50、100、150 μmol/L那可丁組HIF-1α mRNA相對表達量分別為0.39±0.07、1.01±0.06、1.03±0.06、1.02±0.04、0.99±0.08，CoCl2缺氧組細胞HIF-1α mRNA的表達明顯高于常規組(Plt;0.05)，而那可丁組細胞HIF-1α mRNA的表達與缺氧組比較無明顯變化(圖1)。

常規組、缺氧組和50、100、150 μmol/L那可丁組VEGF mRNA相對表達量分別為0.65±0.04、0.94±0.04、0.63±0.04、0.45±0.04、0.21±0.05。缺氧組VEGF mRNA表達明顯增加(Plt;0.05)，那可丁組VEGF mRNA的表達呈劑量依賴性明顯下降(Plt;0.05)，且100、150 μmol/L那可丁組的VEGF mRNA表達還明顯低于常規組(Plt;0.05，圖1)。

2．細胞HIF-1α、VEGF蛋白表達的變化：常規組、缺氧組和50、100、150 μmol/L那可丁組HIF-1α蛋白相對表達量分別為0.08±0.03、0.81±0.04、0.54±0.05、0.38±0.04、0.15±0.03，缺氧組細胞HIF-1α蛋白的表達明顯高于常規組(Plt;0.05)，而可丁組HIF-1α蛋白表達呈劑量依賴性降低(圖2)。

常規組、缺氧組和50、100、150 μmol/L那可丁組VEGF蛋白相對表達量分別為0.40±0.02、0.79±0.04、0.63±0.05、0.26±0.04、0.13±0.04，缺氧組VEGF蛋白表達明顯增加(Plt;0.05)，而那可丁組VEGF蛋白的表達呈劑量依賴性明顯下降(Plt;0.05，圖2)。

圖1各組細胞HIF-1α mRNA(上)、VEGF mRNA(中)和β-actine mRNA(下)的表達

圖2各組細胞HIF-1α蛋白(上)、VEGF蛋白(中)和β-actine 蛋白(下)的表達

討論氧平衡是哺乳動物維持正常生長發育和代謝的基礎，是維持細胞生存的重要因素。許多實體腫瘤具有缺氧的微環境。HIF-1α是在缺氧的細胞核提取物中發現的一種DNA結合蛋白，是介導細胞對缺氧的微環境進行適應反應的關鍵性轉錄調控因子，由α亞單位和β亞單位構成，分別位于人類第14號染色體q21224區和第1號染色體的q21區，其中α亞單位被認為是特異性氧調節亞單位，決定HIF-1α的活性[3]。不同的腫瘤組織中,致癌基因多可通過HIF-1α表達升高上調VEGF的表達,誘導新生血管形成，促進腫瘤的生長[4-6]。

那可丁一直在人體中被作為沒有已知毒性作用的口服鎮咳藥[7-8]。有研究顯示，那可丁屬于植物代謝產物中的芐基異喹林類和(或)微管結合劑，是一個新HIF-1途徑小分子抑制劑[9-10]。用那可丁干預經缺氧劑CoCl2處理的人類神經膠質瘤U87MG和T98G細胞系，可抑制HIF-1α的表達。其機制可能抑制HIF-1α在核內的積累以及通過蛋白酶體使它降解。微管結合劑的一個功能是它們與內皮小管結合發揮抗血管形成的活性。本實驗結果表明，那可丁對HIF-1α mRNA的表達無明顯影響，但可明顯抑制HIF-1α蛋白水平的表達，并且這種抑制作用與藥物濃度顯著相關，說明那可丁是在轉錄水平上調控HIF-1α蛋白的表達。本實驗結果還顯示，那可丁呈濃度依賴性抑制VEGF mRNA和蛋白的表達。由于那可丁對人體無毒性作用，可能為惡性腫瘤的靶向治療提供新的靶點。

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2009-03-06)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.02.022

435000 湖北黃石，黃石市中心醫院肝病科(張翠芳)；華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院消化內科(趙秋、柯曉煜)；武漢市中心醫院消化內科(廖宇圣)

趙秋，Email:Tongji146@sina.com