日本看麥娘對高效氟吡甲禾靈代謝抗性的初步研究

韓瑞娟， 董立堯， 李 俊， 張宏軍(.南京農業大學植物保護學院農藥科學系,農業部作物病蟲害監測與防控重點開放實驗室，江蘇南京 0095；.農業部農藥檢定所生物測定室，北京 0006)

日本看麥娘對高效氟吡甲禾靈代謝抗性的初步研究

韓瑞娟1， 董立堯1， 李 俊1， 張宏軍2
(1.南京農業大學植物保護學院農藥科學系,農業部作物病蟲害監測與防控重點開放實驗室，江蘇南京 210095；2.農業部農藥檢定所生物測定室，北京 100026)

為了明確日本看麥娘對高效氟吡甲禾靈(haloxyfop-R-methyl)的代謝抗性機理，研究了抗性和敏感生物型體內細胞色素P450還原酶(cytochrome P-450 monooxygenases，P450)和谷胱甘肽-S-轉移酶(glutathione-S-transferases,GSTs)的活性差異。結果表明，未用藥劑處理時，抗性日本看麥娘P450與GSTs的活性均高于敏感日本看麥娘。高效氟吡甲禾靈莖葉噴霧處理2 d后，敏感植株反應劇烈，P450與GSTs活性均呈現急劇的變化趨勢，而抗性種群的變化趨勢平緩。處理后第6 d，敏感種群較抗性種群先出現下降趨勢，其活性也明顯低于抗性種群。處理后第10 d活性均降到最低，并且依然低于施藥初期。從而可以得出：高效氟吡甲禾靈被抗性日本看麥娘體內的細胞色素P450還原酶催化，經過羥化作用迅速解毒，并在GSTs的催化下形成了無毒或低毒的化合物，使其免受傷害。表明代謝酶活性增強是日本看麥娘對高效氟吡甲禾靈產生抗性的機理之一。

日本看麥娘; 高效氟吡甲禾靈; 代謝; 抗性；P450; GSTs

日本看麥娘(Alopecurusjaponicus)是我國油菜田的一種惡性禾本科雜草，是制約油菜豐產豐收的主要因素。高效氟吡甲禾靈(haloxyfop-R-methyl)活性高，殺草譜廣，選擇性強，是油菜田防除一年生禾本科雜草的主導藥劑。由于高效氟吡甲禾靈的連年廣泛使用，近年有報道稱日本看麥娘對其產生了明顯的抗藥性[1]。

關于抗性機制的研究，目前主要有兩種：一是靶標酶ACCase結構改變，從而對藥劑不敏感；二是對除草劑解毒代謝能力的增強。Brown等報道，鼠尾看麥娘(Aloecurusmyosuroides)ACCase中異亮氨酸突變為亮氨酸是其對烯禾啶(sethoxydim)產生抗性的原因[2]。Hall等研究表明，英國種群的鼠尾看麥娘對禾草靈(diclofop-methyl)和噁唑禾草靈(fenoxaprop-p-ethyl)產生抗性，在某種程度上是由于其對這兩種藥劑的代謝增強[3]。據報道，抗吡氟禾草靈(fluazifop-p-butyl)的馬唐(Digitariasanguinalis)生物型經14C標記顯示：吡氟禾草靈在其體內的吸收和輸導與敏感型沒有差異，但在抗性馬唐體內能被快速代謝為其他無毒物質。顯然，這種代謝能力的增強在抗性馬唐體內起著重要作用[4]。

在雜草對除草劑的解毒代謝過程中有兩個酶十分重要：細胞色素P450還原酶(cyt P450)[5-6]和谷胱甘肽-S-轉移酶(GSTS )[7-8]。

日本看麥娘對高效氟吡甲禾靈的代謝抗性機理未見報道。因此本文旨在通過測定敏感及抗性日本看麥娘細胞色素P450還原酶和GSTs的活性，明確日本看麥娘對高效氟吡甲禾靈的抗藥性是否與代謝增強相關，從而揭示其代謝抗性機理，并為制定油菜田惡性雜草日本看麥娘的防除策略和延緩抗性種群的發展提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

在安徽、上海、江蘇、浙江等我國油菜田主產區采集有代表性的日本看麥娘成熟種子。其采集地點有：(A)句容油菜田;(B)合肥三十崗油菜田；(C)句容休閑田；(D)江蘇阜寧；(E)常州市武進休閑田；(F)江都休閑田；(G)江都油菜田；(H)浙江紹興油菜田；(I)滁州休閑田；(J)金壇市薛坪上陽油菜田；(K)金壇市金城油菜田；(L)上海南匯區油菜田；(M)金壇市開發區休閑田；(N)常州市武進油菜田；(O)金壇市薛坪上陽休閑田。

1.2 不同種群日本看麥娘對高效氟吡甲禾靈抗藥性水平的測定

采用種子生物測定法。將40粒預先經低溫浸泡過的日本看麥娘種子放于鋪有一層濾紙的培養皿內，加入5 mL高效氟吡甲禾靈藥液，置于光照培養箱內培養(光照:12 h。溫度:白天18 ℃，晚上15 ℃)。藥劑處理13 d后，測量芽長，計算日本看麥娘萌發的抑制中劑量(ED50)，根據ED50值確定抗性及敏感種群。設清水為對照。重復4次。經過一系列試驗得出最適的藥劑劑量(表1)。

表1 用于種子生物測定的藥劑劑量

相對抗性倍數=不同地區日本看麥娘種群的ED50/敏感日本看麥娘種群的ED50

1.3 細胞色素P450還原酶活性測定

1.3.1 供試材料的準備 將土與沙按2 ∶1混合均勻，裝入直徑為9 cm的塑料盆缽內，每盆播30粒低溫浸泡過的日本看麥娘種子，置于光照培養箱內培養,培養條件同1.2。出苗后每盆定苗20株。3周后日本看麥娘長至3～4葉期，用高效氟吡甲禾靈97.2 mg/m2進行莖葉噴霧處理。噴霧采用農業部南京農業機械化研究所生產的3WPSH-500D型生測噴霧塔，圓盤直徑50 cm，主軸轉動速度6 r/min，噴頭孔徑0.3 mm，噴霧壓力0.3 MPa，霧滴直徑100 μm，噴頭流量90 mL/min。分別在處理后第1 d、2 d、3 d、6 d、8 d、10 d采集樣品。設清水為對照。

1.3.2 細胞色素P450微粒體的提取 取約5 cm高的幼苗1.00 g，立即用10 mmol/L的Na2S2O4浸洗，用沙布吸干后放入液氮中。在預冷的研缽中加0.5 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)和1.5 mL提取緩沖液(0.1 mol/L磷酸，pH值7.5,10%甘油,0.1%BSA,5 mmol/L DTT,1 mmol/L LiCO3)研磨，勻漿后于10 000 g離心20 min，取上清液于100 000 g超速離心80 min,將沉淀的微粒體部分懸浮于適當體積的0.1 mol/L磷酸緩沖液(含10%甘油，1.5 mmol/L巰基乙醇，pH值8.5)，貯存于-20 ℃冰箱備用。以上操作均在0～4 ℃條件下進行[9]。

1.3.3 細胞色素P450還原酶的活性測定 參照Feng等[10]的方法。3 mL反應混合液中含有2.8 mL磷酸緩沖液、酶液100 μL、5 mg/mL細胞色素C 100 μL。樣本比色杯中加入5 mg/mL還原型輔酶Ⅱ(NADPH)0.02 mL啟動反應，立即混勻。另取3 mL混合液加入與NADPH等量的緩沖液作為對照。用分光光度計測定550 nm處的光吸收值A，每分鐘測定1次，連續測定3次。以摩爾消光系數21 (mmol/L)-1·cm-1來計算活性。公式如下：

蛋白活性=D×1 000/(21×C)

其中D為吸光值，C為稀釋后樣品的蛋白質濃度(mg/mL)，蛋白活性單位為nmol/(min·mg)。

P450相對活性為P450施藥活性與同期對照活性的比值。

試驗平行測定3次。

1.4 谷胱甘肽-S-轉移酶(GSTs)活性測定

1.4.1 供試材料的準備 同1.3.1。

1.4.2 谷胱甘肽-S-轉移酶(GSTs)的提取 取莖葉組織0.5 g在液氮中冷凍，并快速研磨成粉末。加入pH值7.5,0.1 mol/L Tris-HCL,1 mmol/L的EDTA，14 mmol/L的β-巰基乙醇，7.5%的PVP-40，并用雙層紗布過濾。過濾后組織勻漿離心(4 ℃,15 000 g,20 min)。上清液用0.1倍體積的硫酸魚精蛋白處理后，重新離心。最后用加入硫酸銨至飽和度為80%，如前所述條件下離心，所得蛋白質顆粒在-20 ℃下保存。上述蛋白提取物用2 mmol/L的磷酸鉀緩沖液(pH值6.8)鹽析，過Sephadex G-25柱子，收集餾分。調節蛋白質濃度至10 mg/mL，以備測定酶的活性[11]。

1.4.3 谷胱甘肽-S-轉移酶(GSTs)的活性測定 參照John[12]、吳進才等[13]方法。在3 mL Tris-HCl緩沖液(0.1 mol/L,pH值8,含25 mmol/L還原性谷胱甘肽)中加0.1 mL酶液，25 ℃保溫10 min，加入0.1 mL無水乙醇配制的13 mmol/LCDNB(2，4-二硝基氯苯)，反應10 min后，于340 nm處測得D值。以摩爾消光系數9.5 (mmol/L)-1·cm-1來計算活性。公式如下：

蛋白活性=D×1 000/(9.5×C)

其中D為吸光值，C為稀釋后樣品的蛋白質濃度(mg/mL)，蛋白活性單位為nmol/(min·mg)。

GSTs相對活性為GSTs施藥活性與同期對照活性的比值。試驗平行測定3次。

1.5 蛋白含量測定

參照Bradford(1976)[14]考馬斯亮藍G-250染色法測定，以牛血清蛋白(BSA)為標準曲線。

1.6 數據處理

用DPS軟件數量型數據分析法分別求出高效氟吡甲禾靈對不同日本看麥娘種群的毒力回歸方程、ED50。

2 結果與分析

2.1 不同日本看麥娘種群對高效氟吡甲禾靈的抗性水平

由表2可以看出，不同種群的日本看麥娘對高效氟吡甲禾靈的抗性水平不同。其中句容種群ED50值最大，為1756.00 μg/m2，其相對抗性倍數高達292.90；金壇市薛坪上陽休閑田ED50值最小，為6.00 μg/m2。表明句容種群對高效氟吡甲禾靈已產生明顯的抗性，與本實驗室前期報道結果一致[1]。因此，以句容種群為抗性生物型，薛坪上陽種群為敏感生物型進行試驗。

表2 不同日本看麥娘種群對高效氟吡甲禾靈的抗性水平

注：相對抗性倍數=不同地區日本看麥娘種群的ED50/金壇市薛坪上陽休閑田的日本看麥娘種群ED50

2.2 細胞色素P450還原酶活性

未用藥劑處理時抗性日本看麥娘種群的P450活性為41.86 pmol/(min·mg)，高于敏感日本看麥娘種群27.30 pmol/(min·mg)。圖1顯示，在高效氟吡甲禾靈97.2 mg/m2處理3 d后，敏感日本看麥娘種群P450活性急劇上升，而抗性種群上升趨勢平緩，說明敏感種群受藥劑影響較大，反應激烈。藥劑處理6 d后，敏感種群P450活性開始下降，而抗性種群仍然保持增加趨勢，表明抗性種群對高效氟吡甲禾靈仍有較高的代謝能力。藥劑處理8 d后，抗性種群P450活性也開始出現下降趨勢，但其活性明顯高于敏感種群，這與敏感種群先于抗性種群出現死亡跡象相一致。

結果表明，高效氟吡甲禾靈被抗性日本看麥娘體內的細胞色素P450還原酶催化，迅速降解，可能是日本看麥娘對其產生抗性的機理之一。

2.3 谷胱甘肽-S-轉移酶(GSTs)活性

未用藥劑處理時，抗性日本看麥娘種群的GSTs活性11.01 nmol/(min·mg)，高于敏感日本看麥娘種群6.39 nmol/(min·mg)。圖2顯示，高效氟吡甲禾靈97.2 mg/m2處理2 d后，敏感日本看麥娘種群GSTs活性急劇下降，而抗性種群下降趨勢較緩。藥劑處理3 d后，敏感種群GSTs活性升高，這可能是日本看麥娘本身受到外界環境脅迫后表現出的應激反應。隨后又呈下降趨勢，說明高效氟吡甲禾靈的藥效逐漸顯現。而抗性種群在整個過程中變化都很緩慢，說明抗性種群受藥劑的影響較小。藥劑處理8 d后，敏感及抗性種群體內GSTs活性又呈上升趨勢，但敏感種群明顯低于抗性種群，且均低于施藥初期，這與敏感種群首先出現死亡跡象相一致。

結果表明，經過第一階段的代謝作用產生的代謝產物，在GSTs的催化下形成了對抗性日本看麥娘無毒或低毒的化合物，使其免受傷害，可能是抗性機理之一。

3 討論

除草劑在植物體內通過其官能團或反應基的變化經過3個階段完成全部代謝過程，即代謝作用(metabolism)—綴合作用(conjugation)—分離(separation)，從而使其生物活性完全喪失。第一階段是最重要的，在這一階段中，P450可以對不同類型的除草劑通過脫烷基或羥基化等作用進行修飾[15]，催化眾多親脂除草劑的氧化作用[16]。大量證據證明了細胞色素P450酶系參與了對許多除草劑的代謝和解毒作用[17]。芳環或烷基羥基化是細胞色素P450羥基化酶誘導的除草劑最普遍的代謝反應。

在小麥(Triticumaestivum)中，禾草靈被其體內的細胞色素P450單加氧酶催化的芳基羥化作用迅速解毒[6]。在抗禾草靈的不實野燕麥(Avena sterilis)和鼠尾看麥娘中也發現了相似的代謝途徑[18-19]。有報道稱增強的解毒作用是瑞士黑麥草(Loliumrigidum)和看麥娘(Alopecurusaequalis)的抗藥性機制，這種抗性機制常常是由細胞色素P450單加氧酶活性或表達增強引起的[3，20-21]。

第二階段的代謝主要是合成過程，即酶催化第一階段產生的代謝產物經過綴合作用，形成對植物無毒或低毒的化合物，此類代謝反應主要是由谷胱甘肽-S-轉移酶誘導[16]。多種類型除草劑在雜草體內均是由GSTS催化進行不可逆的綴合作用而導致選擇性的[22]。

噁唑禾草靈能在小麥、大麥(Hordeumvulgare)和止血馬唐(Digitariaischaemum)體內被代謝則是由于在GSTs催化下其羥化丙酸酯基團被親核取代(nucleophilic substitution)[21]。同時在鼠尾看麥娘的抗芳氧苯氧丙酸酯類除草劑生物型中發現了比敏感生物型更高的GSTs活性[7，23]。Western blot分析表明抗噁唑禾草靈的看麥娘體內GSTs活性增強與25 kd多肽和另兩個異常的27 kd和28 kd免疫反應多肽的表達提高相關，因此GSTs的高活性和谷胱甘肽的有效性有助于通過谷胱甘肽與ACCase的軛合使除草劑解毒，從而使看麥娘對噁唑禾草靈產生抗藥性[7]。

為了研究日本看麥娘的代謝與抗性機理的關系，本研究所選用的日本看麥娘種群是本實驗室前期報道的抗性生物型，關于其抗性機理未見報道。本研究結果得出P450活性在抗性與敏感植株體內的變化存在著差異，并且由于測定活性時加入了NADPH，從而可以看出細胞色素P450可以催化高效氟吡甲禾靈使其羥基化。這一結論與Yun等的研究結果[24]相一致。Frear等[25]報道綠磺隆(chlorsulfuron)在小麥體內為羥基化代謝，且為小麥細胞色素P450催化。

未用藥劑處理時抗性日本看麥娘的GSTs與P450活性均高于敏感日本看麥娘。施藥1 d后P450與GSTs的活性均在敏感種群體內發生急劇變化，而在抗性種群中變化趨勢平緩，并且敏感種群首先出現下降趨勢，說明敏感日本看麥娘種群較易受到高效氟吡甲禾靈的影響。隨后抗性種群較敏感種群首先出現上升趨勢，即抗性種群代謝酶活性增強能迅速將體內除草劑代謝使其活性喪失,從而保護自身使其免受傷害。雖然敏感種群也能出現上升趨勢，但其活性依然低于抗性種群，且明顯低于施藥初期。這可能是由于植物本身受到外界環境的刺激而表現出的應激反應，也就解釋了為什么敏感種群首先出現死亡跡象。

研究表明，高效氟吡甲禾靈被抗性日本看麥娘體內的細胞色素P450還原酶催化，經過羥化作用迅速解毒，并在GSTs的催化下形成了無毒或低毒的化合物，使其免受傷害。因此，代謝酶活性增強是日本看麥娘對高效氟吡甲禾靈產生抗性的機理之一。

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S451.22+4

A

1003-935X(2010)01-0003-05

2009-12-25

國家自然科學基金(編號：30971928)；博士點基金新教師類項目(編號：20090097120046)。

韓瑞娟(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為除草劑毒理及抗藥性。E-mail：2007102110@njau.edu.cn。

董立堯，教授，從事除草劑毒理及抗藥性研究。Tel:(025)84395672； E-mail：dly@njau.edu.cn。