IL-21和IL-18對臍血來源的CIK細胞體外作用研究

楊新宇,肖佩玲,方亦兵,段華新,周 明

(湖南師范大學第一附屬醫(yī)院,中國 長沙 410005)

細胞因子殺傷細胞(CIK細胞)最初是外周血單個核細胞在體外經(jīng)多種細胞因子共同培育下獲得的一種異質(zhì)細胞．此種細胞增殖速度快，殺腫瘤活性強，殺瘤譜廣[1]．通過對CIK細胞表面標志分析，研究者發(fā)現(xiàn)其主要效應(yīng)細胞是CD3+CD56+細胞，CD3+CD56+細胞主要來源于CD3+CD56-T細胞 ，并不是來源于單個核細胞中少量CD3+CD56+T細胞的擴增[2]．臍血來源的CIK細胞比外周血來源的CIK細胞增殖速度更快，殺腫瘤活性更強[3]．同一條件下，如果在臍血來源的CIK中擴增這種重要的抗腫瘤免疫前體細胞將具有重要的臨床實用價值在．本實驗中我們嘗試在傳統(tǒng)培養(yǎng)基礎(chǔ)上通過聯(lián)合IL-21和IL-18來擴增CIK細胞，探討它們對CIK細胞誘導、擴增的影響．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1 .1 實驗材料 IL-21和IL-18(Peprotech Ec公司，美國)；臍血(CB)來自我院產(chǎn)科正常足月分娩胎盤；K562細胞(中南大學湘雅醫(yī)學院干細胞研究所)；優(yōu)級胎牛血清和Ficoll人淋巴細胞離液(天津灝陽生物試劑公司)； 伽瑪干擾素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(R&D公司，美國)；MTT試劑盒(上海晶美生物試劑公司)；抗CD3單抗(武漢生物制劑公司)，IL-2(江蘇金絲利藥業(yè)公司)和IFN-γ(上海克隆試劑公司)，F(xiàn)ITC-CD3和PECY5-CD56(BECKMAN COULTER公司，美國)．

1.1.2 實驗標本 胎兒臍血來自我院產(chǎn)科足月、順產(chǎn)、健康的胎兒胎盤臍帶．經(jīng)得家屬同意捐贈臍血，按衛(wèi)生部頒布的《獻血體檢標準》檢驗合格，于第3產(chǎn)程自臍靜脈消毒后用200 mL采血袋全封閉采集臍血, 平均采量80～130 mL．

1.2 實驗方法

1.2.1 單個核細胞(CBMC)的分離和CIK細胞的培養(yǎng) 取臍血50 mL，PBS等體積稀釋，用淋巴細胞分離液分離單個核細胞(CBMC)．將CBMC加入RPMI-1640培養(yǎng)液(含15%胎牛血清)，加入IFN-γ(1 000 U/mL),在37 ℃、5%的CO2孵箱中孵育24 h后放入24孔板中(1×106/mL)．分4組，A組：IL-2+抗CD3單抗(對照組)； B組：IL-2+抗CD3單抗+IL-2l； C組：IL-2+抗CD3單抗+IL-18；D組：IL-2+抗CD3單抗+IL-21+IL-18．各因子劑量參照文獻報道，其中，IL-2：1 000 U/mL、抗CD3單抗：50 ng/mL、IL-2l：100 ng/mL、IL-18：100 ng/mL．每組復種三孔，重復5次；每3 d半量換液，同時全量補充上述細胞因子．

1.2.2 細胞形態(tài)和增殖分析 分別在培養(yǎng)第3，6，9，12，14 d細胞換液時取每組各孔細胞臺盼藍染色后倒置顯微鏡下觀測各組細胞活性，同時用血球計數(shù)儀計數(shù)．

1.2.3 CIK細胞免疫表型的檢測 取1×106細胞放入96孔板中，加15 μL單抗(CD3/CD56)，同時設(shè)陰性對照孔，震蕩；室溫孵育30 min，加PBS洗2遍(1 000 r/min，5 min)，棄上清；再加約1 mL PBS，混勻，流式細胞儀檢測．

1.2.4 培養(yǎng)上清IFN-γ表達的檢測(酶聯(lián)免疫法) 在酶聯(lián)免疫板的各孔中分別設(shè)空白孔、標準品孔、待測樣品孔．標準品孔中加入已稀釋好的不同濃度的標準品IFN-γ各50 μL，除空白孔外，待測樣品孔中每孔加待測樣品50 μL，37 ℃ 30 min后洗板5次，除空白孔外每孔再加入已稀釋好的酶標試劑50 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃溫育30 min．每孔加底物A、B各50 μL，避光，37 ℃ 10 min．每孔加終止液50 μL，混勻，即刻在450 nm處讀數(shù)．結(jié)果計算：以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點．通過標本的OD值計算出其濃度．

1.2.5 MTT顯色法測定三組臍血活化殺傷細胞的殺瘤活性 (1)調(diào)整效應(yīng)細胞，靶細胞的濃度：收獲4組活化臍血殺傷細胞作為效應(yīng)細胞，靶細胞即K562細胞，效靶比為20∶1．(2)實驗組每孔加人效應(yīng)細胞及靶細胞懸液各100 μL混勻，每組典加7孔：同時設(shè)效應(yīng)細胞及靶細胞對照，均設(shè)7孔，各取100 μL，在所有對照孔中各加入RPMI-1640(含10%小牛血清)培養(yǎng)液100 μL， 37 ℃，5%CO2條件下共育24 h．(3)24 h后，離心后吸棄上清液100 μL，加入MTT儲液(5 mg/mL)10 μL，37 ℃，5%CO2條件下，再共育4 h．(4)吸棄上清液后加入Formanzan溶解液100 μL．37 ℃孵育4 h.(5)在酶標儀上570 nm測定OD值．殺傷細胞毒活性%=[1-(試驗孔OD值-單獨效應(yīng)細胞OD值)/單獨靶細胞OD值]×100%．

1.3 統(tǒng)計學分析應(yīng)用SPSS 10.0軟件分析

所有實驗計量資料符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標準差表示．數(shù)據(jù)分析使用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件．多個樣本均數(shù)采用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05表示有統(tǒng)計學意義．

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)代表圖

見圖1：D組第14 d CIK細胞圖，可見大量細胞簇形成，胞體大小不一．

圖1 D組(IL-21+IL-18)細胞形態(tài)圖(×100)

2.2 細胞增殖分析

分析結(jié)果如表1.

表1 不同時期各組CIK細胞數(shù)

注:細胞培養(yǎng)第6 d時，(IL-21+1L-18)CIK組細胞數(shù)較對照組CIK組細胞數(shù)多，差異有顯著性(*P<0.05)；但較(IL-21 )CIK組和 (IL-18)CIK組細胞數(shù)無明顯差異(各P>0.05)；其余各天各組間細胞數(shù)無明顯差異(各P>0.05)．

2.3 CIK細胞表型檢測

第14 d應(yīng)用流式細胞儀對各組細胞進行分析,見圖2.

檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)第14 d加入IL-21的B組CIK細胞與A組比較CD3+CD56+細胞比由(35.4±5.5)%上升至(48.9±4.1)%；加入IL-18的C組CIK細胞與A組比較CD3+CD56+細胞比由(35.4±5.5)%上升至(48.4±5.5)%；同時加入IL-21和IL-18的D組CIK細胞與A組比較CD3+CD56+細胞比由(35.4±5.5)%上升至(57.9±3.7)%．結(jié)果如圖3.

2.4 酶聯(lián)免疫法測各組細胞培養(yǎng)上清IFN-γ濃度

如圖4，在培養(yǎng)第14 d，加入IL-21的B組CIK細胞上清IFN-γ濃度(ng/l)與A組比較由46.2±4.5上升至157.2±10.3；加入IL-18的C組CIK細胞上清IFN-γ濃度與A組比較由46.2±4.5上升至94.0±10.5；同時加入IL-21和IL-18的D組CIK細胞培養(yǎng)上清IFN-γ濃度與A組比較上升至167.6±13.9．

2.5 細胞殺傷力分析

各組細胞對K562細胞殺傷作用影響(圖5) 當效應(yīng)細胞與靶細胞比為20∶1時，加入IL-21的B組CIK細胞對K562細胞的殺傷作用與A組比較由(33.9±4.4)%上升至(72.3±4.6)% ；加入IL-18的C組CIK細胞對K562細胞的殺傷作用與A組比較由(33.9±4.4)%上升至(55.8±6.5)% ；同時加入IL-21和IL-18的D組CIK細胞對K562細胞的殺傷作用與A組比較由(33.9±4.4)%上升至(78.5±3.6)% ．

A組(對照組)，CD3+CD56+%：34.74；B組(IL-21),CD3+CD56+%：45.37%圖2 各組CIK細胞流式細胞術(shù)檢測代表圖

B組(IL-21)、C組(IL-18)和D組(IL-21+IL-18)均高于對照組(A組)(##P<0.01),D組均高于B組、C組(&P<0.05),B組與C組無統(tǒng)計學差別.圖3 培養(yǎng)第14 d各組CIK細胞的CD3+CD56+的百分比(N=4)

B組(IL-21)、C組(IL-18)和D組(IL-21+IL-18)培養(yǎng)液上清IFN-γ濃度均高于對照組(A組)(##P<0.01),D組均高于B組和C組(&P<0.05),且B組高于C組(*P<0.05).圖4 培養(yǎng)第14 d各組CIK細胞培養(yǎng)上清IFN-γ濃度(N=12)

B組(IL-21)、C組(IL-18)和D組(IL-21+IL-18)對K562細胞殺傷活性均高于對照組(A組)(##P<0.01)，D組均高于B組和C組(&P<0.05)，且B組高于C組(*P<0.01).圖5 培養(yǎng)第14 d各組CIK細胞對K562細胞的溶瘤活性(N=7)

3 討論

CIK(Cytokine-Induced Killer cells，CIK)細胞最初是人外周血單個核細胞在體外經(jīng)多種細胞因子如白細胞介素2(Interleukin-2，IL-2)、伽瑪干擾素(interferon-γ, IFN-γ)和抗CD3單克隆抗體(anti-CD3 monocolonal antibody，anti-CD3mAb)等誘導而成的具有殺傷多種腫瘤活性的細胞毒性T細胞．IL-21和IL-18均是近年來發(fā)現(xiàn)的重要免疫調(diào)節(jié)因子，IL-21是IL-2家族成員，主要由CD4+T細胞分泌，在T細胞、NK細胞、B細胞上均發(fā)現(xiàn)其受體，并且IL-21能促進T細胞、NK細胞的增殖和功能[4-5]．IL-21通過對CD8+細胞毒性T細胞的促進作用表現(xiàn)出強大的抗腫瘤作用[6]．IL-21單獨或在某些細胞因子的協(xié)同下通過Star3磷酸化途徑增強NK細胞功能[5]．IL-18具有誘增IFN-γ、增強NK細胞和CTL細胞毒作用，同時能促進T細胞增值活化、增強Fas介導的細胞毒作用表現(xiàn)出積極的抗腫瘤活性，經(jīng)抗CD3分子單克隆抗體作用后的人T細胞在IL-18刺激下可以增殖，并對IL-18呈劑量依賴性[7-8]．IL-18刺激T細胞增殖是IL-2依賴性的，IL-18通過刺激Thl細胞分泌IL-2，由IL-2發(fā)揮間接促增殖效應(yīng)[9]．有學者曾聯(lián)合IL-21和IL-18對外周血T細胞、NK細胞培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合IL-21和IL-18能活化T細胞、NK細胞，并且兩種細胞培養(yǎng)上清IFN-γ濃度明顯增加[6]．由于IL-21和IL-18及其聯(lián)合對T細胞、NK細胞的特殊作用，我們首次嘗試利用IL-21聯(lián)合IL-18培養(yǎng)CIK細胞，觀測其各項指標的變化．

試驗結(jié)果顯示在培養(yǎng)第6 d，IL-21聯(lián)合IL-18培養(yǎng)組CIK細胞總數(shù)最多，并與對照組之間有統(tǒng)計學差別．提示D組CIK細胞擴增啟動時間較早．這一變化可能與兩種細胞因子的聯(lián)合有關(guān)[6]．但D組細胞數(shù)與其它各組間比較并無統(tǒng)計學差別．在培養(yǎng)第14 d，各組CIK細胞總數(shù)無統(tǒng)計學差別．有學者認為IL-21促進T淋巴細胞的增殖的作用是依賴TCR(T cells receptor，TCR)信號途徑，在缺少了TCR刺激活化信號后，它對T淋巴細胞增殖明顯減弱[10]．而抗CD3單抗是促進CIK細胞增殖的主要作用因子，其主要作用受體也是TCR．抗CD3單抗刺激增殖產(chǎn)生的CIK細胞，其表面TCR與原始成熟T細胞TCR結(jié)構(gòu)并不同，CIK細胞TCR結(jié)構(gòu)出現(xiàn)基因重排[11]， IL-21能否對這種TCR結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的T細胞TCR產(chǎn)生作用，目前尚未有報道．

四組CIK細胞對K562細胞殺傷力比較，IL-21和IL-18均能顯著提高CIK細胞的溶瘤活性，其中IL-21聯(lián)合IL-18培養(yǎng)的CIK細胞對腫瘤細胞K562的溶瘤作用最強(優(yōu)于IL-21、IL-18單因子培養(yǎng)組)，其CD3+CD56+細胞比例亦最高．單因子組間比較，IL-21組的溶瘤活性要強于IL-18組，但兩組間CD3+CD56+比值無差別．單因子對CIK細胞的作用結(jié)果與國外報道IL-21單獨對NKT細胞的作用結(jié)果基本一致[12]．目前已經(jīng)證明IL-21的主要生物學作用是免疫平衡的調(diào)節(jié)．IL-21可抑制CD4+CD25+Treg的主要調(diào)節(jié)者轉(zhuǎn)錄因子Foxp3(forkhead box P3， Foxp3)的表達，減少CD4+T細胞的分化形成Treg細胞(Regulatory T cells, Tregs)，從而相應(yīng)地抑制CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的產(chǎn)生，發(fā)揮介導免疫平衡和抗腫瘤作用[13]．腫瘤細胞不能在體內(nèi)徹底清除，一個很重要的原因就是腫瘤細胞高表達FasL，形成免疫逃逸．Fas-FasL途經(jīng)是CIK細胞發(fā)揮抗腫瘤活性的重要途經(jīng)之一[14]．但CIK細胞仍對部分高表達FasL的腫瘤細胞形成免疫逃逸，削弱了CIK細胞的溶瘤活性．CIK細胞的另一抗腫瘤途經(jīng)即通過細胞間黏附分子-1(Intercellular Adhesion Molecule-1，ICAM-1)直接殺傷腫瘤細胞．IL-18能增強Th1細胞上功能性Fasl的表達，有選擇的擴增Fasl介導的Th1細胞的細胞毒作用[15]．

活化的CIK細胞可分泌多種細胞因子，如IL-2、IFN-γ、TNF-a等對腫瘤細胞有直接抑制和間接作用．尤其IFN-γ可以促進腫瘤細胞表面細胞間黏附分子-1(ICAM-1)的表達，提升CIK細胞的抗腫瘤活性，亦是CIK細胞發(fā)揮直接抗腫瘤、治療血液領(lǐng)域移植物抗宿主病的重要手段之一． IL-21促進CIK細胞的IFN-γ的產(chǎn)生，主要也是與Th1細胞和Th2細胞的平衡有關(guān)[16]． IL-18可通過IFN-γ的表達而促進靶細胞對FasL途徑的敏感性，進而促進Fas-FasL途徑介導的NK細胞活性，間接殺傷腫瘤細胞[17]．這可能是IL-21 和IL-18誘導CIK細胞產(chǎn)生大量IFN-γ的原因之一．

綜上所述，IL-21聯(lián)合IL-18能顯著提高臍血來源CIK細胞的抗腫瘤活性，同時產(chǎn)生大量的IFN-γ．我們的試驗研究將為進一步提高CIK細胞過繼免疫治療效果提供試驗依據(jù).

參考文獻：

[1] SCHMIDT-WOLF I G, NEGRIN R S, KIEM H P,etal. Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induce killer cells with potent antitumor cell activity [J]. J Exped, 1991, 174(1):4 770-4 774.

[2] LU P H,NEGRIN R S. A novel population of expanded human CD3+CD56+cells derived from T cell with potent in vivo antitumor activity in mice with severe combined immunodeficiency[J]. J Immunol,1994,153:1 687-1 696.

[3] 王佳祥, 鄭 樹, 劉秋亮. 不同來源CIK細胞和殺傷活性的比較[J]. 第四軍醫(yī)大學學報, 2005, 26(7):616-618.

[4] OSTIGUY V，ALLARD E L, MARQUIS M,etal. IL-21 promotes T lymphocyte survival by activating the phosphatidylinositol-3 kinase signaling cascade[J].J Leukoc Biol, 2007,823：645-656.

[5] TRENGELL M, MATIKAINEN S,SIREN J,etal.IL-21 in synergy with IL-15 or IL-18 enhances IFN-gamma production in human NK and Tcells[J].J Immunol, 2003, 170(11):5 464-5 469.

[6] MA H L, WHITTERS M J, KONZ R F，etal. IL-21 activates both innate and adaptive to generate potent antitumor responses that require perforin but are independent of IFN-gamma[J].J Immunol,2003，171(2):608-615.

[7] SUBLESKI J J，HALL V L，BACK T C，etal．Enhanced antitumor response by divergent modulation of natural killer and natural killer T cells in the liver[J]．Cancer Res，2006，66(22):11 005-11 012．

[8] YOKOYAMA A，MORI S，TAKAHASHI H K，etal．Effect of amodiaquine,a histamine N-Methyhransferase inhibitor, on, Propionibacterium acnes and lipopolysaccharide-induced hepatitis in mice[J]．Eur J Pharmacol，2007,558(1-3):179-184.

[9] MICAUEF M J, OHTSULKI K, KOHNO F．Interfemn-gamnla-inducing factor enhances T helperl cytokine production by stimulated human T cell[J].Eur J Immunol, 1996, 26(7):1 647-1 651.

[10] KASAIAN M T, WHITTERS M J, CARTER L L,etal. IL-21 limits NK cell responses and promotes antigen-specific T cell activation: a mediator of the transition from innate to adaptive immunity[J].Immunity, 2002,16(4):559-569.

[11] GODFREY D I, STANKOVIC S, BAXTER A G. Raising the NKT cell family[J]. Nat Immunol, 2010, 11(3):197-206.

[12] BAXEVANIS C N, GRITZAPIS A D, PAPAMICHAIL M,etal. In Vivo Antitumor Activity of NKT Cells Activated by the Combination of IL-12 and IL-18[J]. The Journal of Immunology, 2003, 71(6):2 953-2 959

[13] MONTELEONE G, PALLONE F, MACDONALD T T,etal. Interleukin-21: a critical regu lator of the balance between effector and regulatory T-cell [J]. Cell responses, 2008, 29(6):290-294.

[14] VENLERIS M R, KOMACKER M, MAILANDER V,etal. Resistance of ex vivo expanded CD3+CD56+T cell to Fas-mediated apoptosis[J]. Cancer immunol immunothr, 2000, 49(6):335-345.

[15] TSUTSUI H, MATSUI K, KAWAD N. IL-18 accounts for both TNF-alpha and Fas ligand-mediated hepatotoxic pathways in endotoxin-induced liver injury in mice [J]. Im munol, 2007, 159 (8):3 961-3 967.

[16] MINAMI K, YANAGAWA Y, IWABUCHI K,etal. Negativefeedback regulation of T he lper type 1 (Th1)/Th2 cytokine balance via dendritic cell and natural killer T cell interactions[J]. Blood, 2005, 106(5):1 685-1 693.

[17] TANG Z H, QIU W H, WU G S,etal. The immunotherapeutic effect of dendritic cells vaccine modified with interleukin-18 gene and tumor cell lysate on mice with pancreatic carcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2002, 8(5):908-912.